Масса лады приоры: Технические характеристики LADA Priora хэтчбек

Содержание

Габариты приоры седан и хэтчбек. Новая Лада Приора универсал, цена, фото, видео, комплектации, технические характеристики Lada Priora universal. Кузов и компоновка автомобиля

Лада приора хэтчбек (ВАЗ 2172) — это отечественный автомобиль лада приора в кузове хэтчбек. Этот тип кузова пользуется не меньшим спросом, чем седаны. Характеристики лада приора хэтчбек практически не отличаются по своим показателям от характеристик своего собрата — седана. Ниже представлена таблица с техническими характеристиками ВАЗ 2172.

Технические характеристики лада приора хэтчбек отличаются только по типу кузова и внутренней отделке салона. В Приоре хэтчбек больше багажник, особенно если разложить заднее сиденье. По типу и характеристикам двигателей машины не отличаются. Приора хэтчбек комплектуется только одним двигателем — 16-клапанным 1.6 литра, который выдает 98 л.с. мощности. Это весьма неплохой показатель для автомобиля весом чуть больше 1,5 тонн.

Характеристики приора хэтчбек

Двигатель 1.6 л, 16-кл (Евро-3)
Длина, мм 4210
Ширина, мм 1680
Высота, мм
1420
База, мм 2492
Колея передних колес, мм 1410
Колея задних колес, мм 1380
Объем багажного отделения, дм 3 400
Масса в снаряженном состоянии, кг 1088
Полная масса автомобиля, кг 1578
Допустимая полная масса буксируемого прицепа с тормозами, кг 800
Допустимая полная масса буквируемого прицепа без тормозов, кг 500
Колесная формула/ведущие колеса 4х2/передние
Компоновочная схема автомобиля переднеприводная, расположение двигателя переднее, поперечное
Тип кузова/количество дверей хэтчбек/5
Тип двигателя бензиновый, четырехтактный
Система питания Распределенный впрыск с электронным управлением
Количество и расположение цилиндров 4, рядное
Рабочий объём двигателя, см 3 1596
Максимальная мощность, кВт/об.мин 72/5600
Максимальный крутящий момент, Нм при об/мин 145/4000
Топливо неэтилированный бензин АИ-95 (min)
Расход топлива по ездовому циклу, л/100 км 7,2
Максимальная скорость, км/ч 183
Коробка передач С ручным управлением
Число передач 5 вперед, 1 назад
Передаточное число главной пары 3,7
Рулевое управление типа «шестерня-рейка», рулевой привод с электроусилителем
Шины 185/65 R14 86(H)
175/65 R14 82(H)
185/60 R14 82(H)
Емкость топливного бака 43

Фото Лада Приора хэтчбек

Описание

Как только он поступил в продажу, многие захотели понять — новый это или просто переделанный автомобиль? Конечно, можно долго ломать голову, но нам интересны другие характеристики этой модели. Говоря простым языком, Лада Приора седан — это сейчас тот автомобиль, который тянет весь великий и могучий АВТОВАЗ. Это лидер по продажам на российском авторынке. На сегодняшний день ни одна из бюджетных иномарок и близко не может подобраться к цифрам продаж Лада Приора седан в России.

Главные козыри — это вполне современная и спортивная внешность, хорошие тяговитые двигатели объемом 1.6 литра (8- и 16-клапанные) и, конечно, относительно невысокая стоимость по сравнению с иномарками подобного класса. Если бы не ужасное качество сборки, то этот автомобиль вполне смог бы стать лидером в своем классе, в том числе среди бюджетных недорогих иномарок. Но по сравнению со своим предшественником на конвеере — десяткой, Лада Приора седан — это глобальный шаг в развитии отечественного автопрома.

Lada Priora седан (он же ВАЗ 2170) — это оптимальное соотношение цена/качество. Это легкость в эксплуатации и обслуживании, надежность и практическая безопасность. В Самарской области — Лада приора седан по праву возглавляет топ самых популярных машин. И так будет до тех пор, пока на авторынке не появится автомобиль с набором тех же характеристик, но лучший по качеству. Качество сборки остается главным минусом этого автомобиля и всех автомобилей, собираемых в Тольятти.

Технические характеристики ВАЗ 2170 (приора седан)

Двигатель 1.6 л, 8-кл 1.6 л, 16-кл
Длина, мм 4350 4350
Ширина, мм 1680 1680
Высота, мм 1420 1420
База, мм 2492 2492
Колея передних колес, мм 1410 1410
Колея задних колес, мм 1380 1380
Объем багажного отделения, дм 3 430 430
Масса в снаряженном состоянии, кг 1088 1088
Полная масса автомобиля, кг 1578 1578
Допустимая полная масса буксируемого прицепа с тормозами, кг 800 800
Допустимая полная масса буквируемого прицепа без тормозов, кг 500 500
Колесная формула/ведущие колеса 4х2/передние 4х2/передние
Компоновочная схема автомобиля переднеприводный переднеприводный
Тип кузова/количество дверей седан/4 седан/4
Тип двигателя бензиновый, четырехтактный
Система питания Распределенный впрыск с электронным управлением
Количество и расположение цилиндров 4, рядное 4, рядное
Рабочий объём двигателя, см 3 1596 1596
Максимальная мощность, кВт/об.мин 59.5 / 5200 72 / 5600
Максимальный крутящий момент, Нм при об/мин 120 / 2700 145 / 4000
Топливо неэтилированный бензин АИ-95 (min)
Расход топлива по ездовому циклу, л/100 км 7,2 7,2
Максимальная скорость, км/ч 172 183
Коробка передач С ручным управлением С ручным управлением
Число передач 5 вперед, 1 назад 5 вперед, 1 назад
Передаточное число главной пары 3,7 3,7
Рулевое управление типа «шестерня-рейка», рулевой привод с электроусилителем
Шины 185/65 R14 86(H)
Емкость топливного бака 43 43

Фотогалерея Lada Priora

Выпуск рестайлинговой LADA Priora («Лада Приора») начался с ноября 2013 г. С конвейера ОАО «АВТОВАЗ» сходят следующие автомобили этого семейства: ВАЗ-2170 — с кузовом седан, ВАЗ-2171 — с кузовом универсал, ВАЗ-2172-с кузовом хэтчбек (пятидверный и трехдверный). На автомобили могут устанавливаться два четырехцилиндровых шестнадцатиклапанных двигателя объемом 1596 см3 и мощностью 98 и 106 л.с. Нормы токсичности соответствуют стандарту Евро-4. Автомобили комплектуются пятиступенчатой механической коробкой передач с приводом на передние колеса.

Обновленная LADA Priora соответствует современным требованиям по пассивной безопасности. Передний и задний бамперы изготовлены из ударопрочного материала, что обеспечивает поглощение энергии удара при столкновении. Центральные стойки, крыша и пороги имеют усиленную конструкцию. Во всех дверях для повышения стойкости при боковом ударе установлены металлические усилители.

Информация актуальна для моделей Приора 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018 года выпуска.

Габаритные размеры

В базовую комплектацию автомобиля входят: регулируемая по углу наклона рулевая колонка, электростеклоподъемники передних дверей, подушка безопасности водителя, наружные зеркала с электроприводом. Фары автомобиля могут работать в режиме дневных ходовых огней, которые не слепят водителей на встречной полосе и значительно снижают энергопотребление.

Для более полного удовлетворения потребностей клиентов в комплектации автомобиля предусмотрены различные опции. К ним относятся: подушка безопасности переднего пассажира, преднатяжители ремней безопасности передних сидений, антиблокировочная система тормозов (ABS), система электронного контроля устойчивости (ESC), круиз-контроль, кондиционер, электростеклоподъемники всех дверей, электрическая регулировка зеркал, современная мультимедийная система, бортовой компьютер, автоматическое управление очистителем ветрового стекла, автоматическое управление внешним освещением, повторители поворотов в боковых зеркалах заднего вида, противотуманные фары, электрообогрев ветрового стекла.

LADA Priora — это компактный, экономичный автомобиль, хорошо адаптированный к условиям нашего климата и особенностям российских дорог.

Общие данные

Тип кузова Седан Универсал Хэтчбек, 5-дверный Хэтчбек, 3-дверный
Количество дверей 4 5 5 3
Количество мест (при сложенном заднем сиденьи)
Снаряженная масса, кг
Разрешенная максимальная масса, кг 1578 1593 1578 1578
Допустимая полная масса буксируемого прицепа, кг:
оборудованного тормозами
не оборудованного тормозами
Объем багажника (5/2 места), л 430 444/777 360/705
Максимальная скорость (двигатель 21126/21127), км/ч
Время разгона до 100 км/ч (двигатель 21126/21127), с
Расход топлива (двигатель 21126/21127), л/100 км: смешанный цикл
Емкость топливного бака, л

Двигатель

Модель 21126 21127
Тип двигателя

Бензиновый, рядный, четырехтактный, четырехцилиндровый

Расположение

Спереди, поперечно

Клапанный механизм

DOHC, 16 клапанов

Диаметр цилиндра х ход поршня, мм
Рабочий объем, см3
Номинальная мощность, кВт (л.с.) 72 (98) 78 (106)
5600 5800
Максимальный крутящий момент, Н-м 145 148
при частоте вращения коленчатого вала двигателя, мин-1 4000 4200
Система питания Распределенный впрыск топлива Распределенный впрыск топлива. Изменяемая длина каналов впускного трубопровода
Топливо Неэтилированный бензин с октановым числом не ниже 95
Система зажигания Электронная, входит в состав системы управления двигателем
Нормы токсичности Евро-4

Ходовая часть

Передняя подвеска Независимая, типа МакФерсон, с телескопическими амортизаторными стойками, винтовыми пружинами, поперечными рычагами, продольными растяжками и стабилизатором поперечной устойчивости
Задняя подвеска Полунезависимая, с винтовыми цилиндрическими пружинами, телескопическими гидравлическими амортизаторами и продольными рычагами, соединенными поперечной балкой U-образного сечения и встроенным в нее стабилизатором поперечной устойчивости торсионного типа
Колеса Дисковые, стальные или легкосплавные (запасное колесо — стальное)
Размер колеса 5,0Jx14h3; 5,5Jx14h3; 6,0Jx14h3; PCD 4×98; DIA 58,6; ET 35
Шины Радиальные, бескамерные
Размер шин 175/65R14; 185/60R14; 185/65R14
Вид снизу на автомобиль (брызговик силового агрегата для наглядности снят): 1 — ниша для запасного колеса; 2 — основной глушитель; 3 — топливный фильтр; 4 — балка задней подвески; 5 — трос стояночного тормоза; 6 — топливный бак; 7 — дополнительный глушитель; 8 — металлокомпенсатор; 9 — привод переднего колеса; 10 — поддон картера двигателя; 11 — коробка передач
Вид снизу на переднюю часть автомобиля (брызговик силового агрегата для наглядности снят): 1 — тормозной механизм переднего колеса; 2 — растяжка передней подвески; 3 — компрессор кондиционера; 4 — поддон картера двигателя; 5 — поперечина передней подвески; 6 — стартер; 7 — коробка передач; 8 — привод левого колеса; 9 — рычаг передней подвески; 10 — штанга стабилизатора поперечной устойчивости; 11 — тяга управления коробкой передач; 12 — реактивная тяга механизма управления коробкой передач; 13 — труба дополнительного глушителя; 14 — катколлектор; 15 — привод правого колеса
Заводские размеры по ГОСТ — 2.104-68. Книга содержит 38 страниц, в том числе Нива, Гранта, Нива-Шевроле, Ока, Калина, Надежда. Необходимые технические параметры для восстановления и ремонта.


Геометрические размеры кузова: Лада приора 2170, 1272. Полные размеры кузова,
поперечные размеры, днища, дверей, моторного отсека, задней двери. СКАЧАТЬ

Новая Приора, или Приора 2

Из данной статьи, вы узнаете об основных изменениях и рестайленге автомобиля Лада Приора (2014 года выпуска), комплектации «Норма+».
Визуально автомобиль несильно изменился, то есть те люди, которые не особо разбираются в отечественных авто, разницы не заметят.

Самым ярко выраженным изменением внешнего вида Приоры, является передний и задний бампера. Их внешний вид приобрел спортивный характер, и выглядит очень даже неплохо, чем редко может похвастаться отечественный автопром.

Что можно сказать про двигатель? Здесь нас ничем не порадовали, все тот же 16-ти клапанный движок, мощностью 98 «лошадок», который, в принципе, неплохо себя зарекомендовал.

Но, производитель обещает, что в комплектации «люкс», будет новый движок, с большей мощностью, улучшенной динамикой, изменяемой длинной впускного коллектора и другими фишками.

Обратим внимание на салон, сразу можно сказать, что основные изменения произошли именно тут. Обивка салона выполнена в черных тонах из того же материала, то же можно сказать и про пластик.

В данной комплектации имеется сенсорный дисплей, как на Калине, не будем уделять ему особого внимания. Панель приборов тоже не очень сильно изменилась: слева — тахометр, под ним расположен указатель датчика температуры, а справа – спидометр. Между ними бортовой компьютер, такой, как на 2-й Калине. Все понятно, просто и эргономично.

Также, в комплектацию входит кондиционер, электропривод зеркал (с подогревом), противотуманные фары, два стеклоподъемника. Видоизменен руль, выглядит он, практически, так же, как у «Гранты», а на панели имеется удобно расположенная кнопка «громкой связи», которая работает через Bluetooth.
Одним из значительных плюсов является обогрев лобового стекла — отличная опция для российского климата. КПП без изменений.
В общем, рестайлинг не вызвал отрицательных эмоций, хотя автолюбители рассчитывали на большее.

Тем, кто интересуется вопросом покупки автомобиля «Лада Приора» универсал, технические характеристики кузова, двигателя и подвески одинаково важны. «Лада Приора» — прямой наследник и продолжатель флагманского семейства моделей ВАЗ 2110 Волжского автозавода. В конструкцию машины было внесено несколько сотен изменений, поэтому модели ВАЗ-2170, ВАЗ-2171 и ВАЗ-2172 (седан, универсал и хэтчбек соответственно) принято считать отдельным семейством. Первые седаны поступили в продажу в 2007 году, а универсалы — в 2009. Lada Priora универсал — это самый практичный и вместительный автомобиль в семействе. В конце 2015 года АвтоВАЗ прекратил выпуск и приём заказов на эту модель.

Варианты исполнения «Приоры» универсал

Для «Лады Приоры» универсал возможны три варианта комплектации:

  1. «Стандарт» — самая дешёвая (не выпускается с 2014 года).
  2. «Норма», в которой предусмотрены подушка безопасности для водителя, система тормозов с вакуумным усилителем, дисковые передние тормоза, усилитель рулевого управления, инерционные ремни безопасности, противоугонная сигнализация, ходовые огни для светлого времени суток, тканевый салон, электропривод обогреваемых наружных зеркал.
  3. «Лада Приора» универсал «Люкс» отличается тем, что в ней есть подушки безопасности для пассажирских сидений первого ряда, датчик дождя, электростеклоподъёмники в задних дверях, литые диски. Отделочный материал салона — алкантара (искусственная замша). Положение передних сидений можно регулировать. В некоторых случаях «Лада Приора» универсал «Люкс» оснащена парктрониками и навигатором.

В 2013 году прошёл рестайлинг автомобиля. Внешне универсал 2013 года и универсал 2014 года мало отличаются. На новом варианте появились обновлённая решётка радиатора, подворотники на боковых зеркалах, изменились передний и задний бамперы, а в фонарях были установлены светодиоды.

Салон «Приоры» универсал 2013 года претерпел серьёзные изменения. Он был модернизирован при участии итальянской дизайн-студии Carcerano. Автомобиль теперь оснащается трехспицевым рулём, в центральной консоли устанавливается цветной монитор для управления стереосистемой и отражения информации навигатора. В старших комплектациях сиденья переднего ряда оснащаются дополнительными подушками безопасности и регулируемым подогревом.

Кузов и компоновка автомобиля

Тип кузова ВАЗ 2171 — пятиместный пятидверный универсал. Пятая дверь цельная, открывается вверх. Габаритные характеристики «Лада-Приора» универсал (длина кузова, ширина и высота) составляют 4210, 1680 и 1420 мм соответственно. Высота указана с учётом рейлингов, которые не снимаются. Для автомобиля «Лада-Приора» универсал предлагаются 10 вариантов цвета кузова: от чёрного и тёмно-красного до белого и серебристого. «Лада-Приора» универсал цвета «снежная королева» больше всего подходит для южных районов, поскольку меньше нагревается от солнца. Летом в автомобили такого цвета будет не так жарко.

База автомобиля (расстояние между передней и задней осями) составляет 2492 мм. Передняя колея — 1410 мм, задняя несколько больше, ее размер равен 1380 мм. Клиренс (или дорожный просвет) составляет 170 мм. Багажник универсала Priora имеет объем 444 кубических дм, а при сложенных сидениях заднего ряда объем возрастёт до 777 кубических дм, но в ровный пол сидения не складываются. «Лада Приора 2171» имеет переднеприводную компоновочную схему с передним поперечным расположением двигателя. Колёсная формула — 4×2 (автомобиль имеет 4 колеса, из которых 2 являются ведущими).

В линейке моделей АвтоВАЗа «Лада Приора» универсал ближе всего к универсалу «Калина». Что лучше: «Калина» универсал или «Приора» универсал, точно определить нельзя. «Калина» на 30 см короче, и багажник у неё на 30 л меньше. Но «Приору» уже не выпускают, поэтому купить абсолютно новый автомобиль невозможно, как и провести тест-драйв «Лада-Приора» универсал в автосалоне.

Силовой агрегат автомобиля

Возможны три варианта двигателя:

  • 8-клапанный движок ВАЗ-2116, имеющий мощность 90 лошадиных сил;
  • 16-клапанный мотор ВАЗ-21126 мощностью 98 лошадиных сил. Модификация универсала с двигателем 21126 (заводское обозначение ВАЗ 217130) — самая доступная на вторичном рынке;
  • 16-клапанный двигатель ВАЗ-21127, выдающий мощность в 106 лошадиных сил, выигрывает по параметрам экономичности и надёжности.

Базовым двигателем модели «Лада Приора 2171» является бензиновый, четырёхтактный, четырёхцилиндровый (цилиндры расположены в ряд) 16-клапанный двигатель ВАЗ-21127 с распределённым впрыском. Этот двигатель появился после доработки мотора ВАЗ-21126 в части улучшения системы впуска. На ВАЗ 21127 вместо одного датчика массового расхода воздуха установлены два: абсолютного давления и температуры воздуха. Это позволило избавиться от известной проблемы предыдущей модели — колебаний частоты вращения коленвала на малых оборотах.

Объем этого мотора — 1596 кубических см, диаметр каждого из четырёх цилиндров — 82 мм, ход поршня — 75,6 мм, степень сжатия — 11. Октановое число используемого бензина — 95. Этот мотор развивает мощность до 106 лошадиных сил при скорости вращения коленчатого вала 5800 об./мин, а его максимальный крутящий момент составляет 148 Нм при 4200 об./мин. Очевидно, что характеристики ВАЗ «Приора» с двигателем 21127 на 8 лошадиных сил и на 3 Нм выше, чем у автомобиля той же марки с движком 21126.

Предельная скорость «Приоры» универсал с двигателем 21127 составляет 183 км/час, разгон до сотни возможен за 11,5 с при полной массе 1578 кг. Расход топлива в смешанном цикле — 6,8 л на 100 км, а на трассе расход топлива составляет 5,4 л на 100 км. Топливный бак вмещает 43 л горючего. Производитель заявляет ресурс двигателя в 200 тыс. км.

Популярный вопрос: Сколько Весит Лада Приора?

А вот с высотой не всё так просто: её мерят от земли до крыши автомобиля; высота рейлингов в общую высоту кузова не входит. Габаритные размеры Лада Приора от 4210 x 1680 x 1435 до 4350 x 1680 x 1420 мм, а масса от 1088 до 1185 кг.

Какой вес у Приоры хэтчбек?

Вес хэтчбека Лада Приора (ВАЗ 21723) 1088 кг – выпуска до 2013 года. Здесь учитывается, что автомобиль имеет полное оснащение, заправлен полностью, и управляется водителем, вес которого 75 кг. Пассажиры и груз при этом не перевозятся; В 2013 году после рестайлинга снаряженная масса стала достигать 1185 кг.

Сколько весит Приора и Веста?

— масса – 1 230 кг (1 670 кг) против 1 163 кг (1 578 кг). Габариты LADA Vesta. Колесная база новой модели также заметно шире и составляет 2 635 мм, тогда как у конкурента лишь 2 492 мм.

Что такое Лада Приора?

LADA Priora — семейство российских автомобилей III группы малого класса, выпускавшихся ПАО «АвтоВАЗ» c 2007 по 2018 год. Головной моделью семейства является ВАЗ-2170.

Сколько весит Приора без нагрузки?

Габаритные размеры Лада Приора от 4210 x 1680 x 1435 до 4350 x 1680 x 1420 мм, а масса от 1088 до 1185 кг.

Сколько весит Приора купе?

Что касается габаритов, то длина купе составляет 4210 мм в базе и 4243 мм в топовом исполнении, ширина кузова во всех случаях равна 1680 мм, а высота – 1435 мм. Колесная база купе составляет 2492 мм. Снаряженная масса не превышает 1185 кг.

Сколько литров в баке Приора универсал?

Объем топливного бака Лада Приора составляет 43 л.

Сколько кузовов у приоры?

Автомобили ВАЗ 2170 Lada Priora I поколения имеют такие варианты кузова: 4-дверный седан, 5-дверные хэтчбек и универсал, и 3-дверный купе.

Какой вес у ваз 2106?

А вот с высотой не всё так просто: её мерят от земли до крыши автомобиля; высота рейлингов в общую высоту кузова не входит. Габаритные размеры Лада 2106 4166 x 1611 x 1444 мм, а масса от 1035 до 1050 кг.

Сколько весит Веста универсал?

Габаритные размеры Лада Веста от 4410 x 1764 x 1497 до 4410 x 1764 x 1512 мм, а масса от 1230 до 1280 кг.

Сколько весит Веста СВ?

Технические характеристики модельного ряда автомобиля LADA. Характеристики и описание комплектаций, габариты LADA: от 1478 x 1764 x 4410 до 1532 x 1785 x 4424, вес автомобиля: 1670 кг, а также характеристики трансмиссии, двигателя и других показателей авто.

Какие сиденья можно поставить на Приору?

Вот лишь некоторые популярные примеры:

  • BMW E60. Кресла в этих моделях баварских автомобилей в большинстве своем были кожаные, а также оснащены электрическим приводом и прочими дополнениями, которые явно понравятся владельцу автомобиля.
  • Hyundai i40 или Hyundai i30.
  • Skoda Octavia A5.
  • Ford Focus.
  • Recaro.

Почему Приоры больше не выпускают?

О том, что Ладу Приору больше не будут выпускать, в середине июля заявил вице-президент АВТОВАЗа по продажам и маркетингу Ян Птачек. По его словам, седан снимают с производства в связи с появлением новых моделей Lada, таких как Vesta и XRAY, и, соответственно, снижением спроса на старую модель.

Какие бывают Приоры?

LADA Priora

  • LADA Priora седан
  • LADA Priora универсал
  • LADA Priora хэтчбек 3-дв.
  • LADA Priora хэтчбек 5-дв.

Сколько Рестайлингов у приоры?

Такого понятие как как первое и второе поколение у лады приоры просто нет. Оно у нее — всего одно. Но есть также рестайлинг, обновление, которое было произведено в 2013 году. Итак, Приора рестайлинг 2013 года отличается от дорестайлинговой прежде всего иным передним бампером, оптикой в фарах, литыми дисками.

Справочник : Lada Priora 2170 ( каталог 2007г.) (Лада Приора: 2170)- описание, характеристики, история.

Модель Cедан 1,6 л. 16-кл. (Евро-3) Хэтчбек 1,6 л. 16-кл. (Евро-3)
Длина, мм 4350 4210
Ширина, мм 1680 1680
Высота, мм 1420 1420
База, мм 2492 2492
Колея передних колес, мм 1410 1410
Колея задних колес, мм 1380 1380
Объем багажного отделения, куб. дм. 430 400
Масса в снаряженном состоянии, кг 1088 1088
Полная масса автомобиля, кг 1578 1578
Допустимая полная масса буксируемого прицепа с тормозами, кг 800 800
Допустимая полная масса буксируемого прицепа без тормозов, кг 500 500
Колесная формула / ведущие колеса 4 х 2 / передние 4 x 2 / передние
Компоновочная схема автомобиля переднеприводный переднеприводная, расположение двигателя переднее, поперечное
Тип кузова / количество дверей седан / 4 хэтчбек / 5
Тип двигателя бензиновый, четырехтактный бензиновый, четырехтактный
Система питания распределенный впрыск с электронным управлением распределенный впрыск с электронным управлением
Количество и расположение цилиндров 4, рядное 4, рядное
Рабочий объём двигателя, куб. см 1596 1596
Максимальная мощность, кВт / об.мин. 72/5600 72/5600
Максимальный крутящий момент, Нм при об/мин 145/4000 145/4000
Топливо неэтилированный бензин АИ-95 (min) неэтилированный бензин АИ-95 (min)
Расход топлива по ездовому циклу, л/100 км 7.2 7,2
Максимальная скорость, км/ч 183 183
Коробка передач с ручным управлением с ручным управлением
Число передач 5 вперед, 1 назад 5 вперед, 1 назад
Передаточное число главной пары 3,7 3,7
Рулевое управление типа »шестерня-рейка», рулевой привод с электроусилителем типа »шестерня-рейка», рулевой привод с электроусилителем
Шины 185/65 R14 86(H) 185/65 R14 86(H), 175/65 R14 82(H), 185/60 R14 82(H)
Емкость топливного бака, л 43 43

Технические характеристики Лада Приора седан ВАЗ-2170

Модификации автомобиля

2170 1.6

2170 1.6 16V

Двигатель

Расположение двигателя

Спереди поперечно

Объем двигателя

1596 см3

Количество цилиндров / Клапанов на цилиндр

4 / 2

4 / 4

Система питания

Распределенный впрыск

Мощность (л.с / об. мин)

80 / 5200

98 / 5600

Крутящий момент (Нм / об.мин)

120 / 2700

145 / 4000

Тип топлива

АИ-95

Трансмиссия

Колесная формула / ведущие колеса

4Х2 / передние

Коробка передач

механическая

Число передач

5

Рулевое управление

Тип

Реечного типа

Усилитель

Есть

Тормозная система

Передние тормоза

Дисковые

Задние тормоза

Барабанные

Кузов

Тип кузова / количество дверей

Седан / 4

Кол-во посадочных мест

5

Длина

4210 мм

Ширина

1680 мм

Высота

1435 мм

Колесная база

2492

Колея передних колес, мм

1410

Колея задних колес, мм

1380

Клиренс

160 мм

Объем багажника

360 / 705

Снаряженная масса

1088

Допустимая масса

1578

Эксплуатационные характеристики

Время разгона до 100 км / ч

14 с

11.5 с

Максимальная скорость

172 км / ч

183 км / ч

Размер шин

R14 (175 / 65) (185 / 65)

Расход топлива городской цикл (л / 100 км)

8.3

8.5

Расход топлива загородный цикл (л / 100 км)

6.6

6.7

Объем бака

43

 

Объем багажника приора седан. Технические характеристики лада приора

Размеры рестайлинговой Лады Приоры существенно не изменились. Хотя за счет новых передних и задних бамперов длина Lada Priora изменилась на несколько миллиметров.

По прежнему седан Lada Priora рестайлинг имеет самую большую длину, которая в новой версии составляет 4 350 мм. Длина универсала на 1 сантиметр короче, а вот хэтчбек Приора еще меньше, длина этой версии кузова составляет 4210 мм. Ширина всего семейства составляет 1 680 мм и колесная база одинакова для всех 2 492 мм. А вот высота у всех разная, седан Лада Приора 1 420 мм, хэтчбек 1 435 мм, а вот универсал вообще 1 508 мм в высоту. Большая высота универсала Priora объясняется наличием рейлингов на крыше. У хэтчбека же конструкция задней части кузова такова, что автомобиль получился выше седана.

Что касается дорожного просвета или клиренса Лада Приора, то производитель указывает на цифру 165 мм у седана и хэтчбека, а у универсала Lada Priora клиренс составляет 170 мм. Однако по факту дорожный просвет больше, достаточно взять в руки рулетку и убедится в этом. Но производитель не ошибается, просто указывает дорожный просвет автомобиля при полной загрузке. В то же самое время производители иномарок хитрят и указывают дорожный просвет своих автомобилей в не нагруженном состоянии. поэтому реальный дорожный просвет иномарок и их официальные данные часто не совпадают.

Объемы багажного отделения у новой версии Лада Приора во всех трех кузовах мало изменились. Объем багажника седана составляет 430 литров. Объем багажного отделения хэтчбека Priora меньше, всего 306 литров, но если сложить задние сидения (чего нельзя сделать в седане), то объем возрастает до 705 литров. В Приора универсал объем багажного отделения составляет 444 литров, а при сложенных сидениях достигает 777 литров. К сожалению задние сидения не складываются в ровень с полом, да и большие колесные арки съедают довольно много багажного пространства.

Размеры Lada Priora седан хэтчбек универсал
Длина, мм 4350 4210 4340
Ширина 1680 1680 1680
Высота 1420 1435 1508
Колея передних колес 1410 1410 1414
Колея задних колес 1380 1380 1380
Колесная база 2492 2492 2492
Объем багажника, л 430 360 444
Объем при сложеных сидениях 705 777
Объем топливного бака 43 43 43
Дорожный просвет, мм 165 165 170

Что касается размера шин Лада Приора, то производитель рекомендует устанавливать диски 14 дюймов. Размер покрышек может быть такой 175/65 R14 или 185/60 R14 или такой 185/65 R14. Самое интересное, что сегодня даже на Лада Гранта или Калина в хорошо упакованных комплектациях “Автоваз” предлагает 15-дюймовые колеса в качестве штатных. Почему такого нет на Приоре не понятно, хотя это не останавливает владельцев этих машин, которые ставят на свои Lada Priora колеса гораздо большего размера.

myautoblog.net

Габаритные размеры Приоры | PrioraPRO

Автомобили Лада Приора разработаны специально для динамичных и стремительных городских дорог. Внешний вид их отличается своей собранностью, универсальностью и резвостью. Габаритные размеры Приоры подчеркивают её индивидуальность – для каждой модели, будь то хетчбек, седан или универсал, разработаны свои собственные габариты:

Хетчбек по своей натуре, автомобиль более молодежный, за счет этого и более легкий и спортивный – его размеры: длина 4210 мм, ширина 1680 мм, высота 1435 мм;

Более увесистый седан имеет размеры: длина 4400 мм, ширина 1680 мм, высота 1420 мм;

Приземистый и солидный универсал соответствует следующим параметрам: длина 4340 мм, ширина 1680 мм, высота 1508 мм;

Красавец Сoupe, быстрый и динамичный, имеет габариты: длина 4243 мм, ширина 1680 мм, высота 1435 мм.

Габаритные размеры Лада Приоры мягко сочетаются со стилем её кузова. Это подчеркивается геометричными линиями, изящно выполненной решеткой радиатора, элегантными фарами как задними, так и передними. Добавляют уникальности открытые передние и задние арки колес, которые подтянуты к колесной арке задним бампером. Такое сочетание делает автомобиль приподнятым, обращающим на себя внимание.

Кроме этого, габаритные размеры на Приоре может уверенно сопоставить прекрасной аэродинамике. При движении на высоких скоростях, в автомобиле обеспечен баланс подъемных и прижимных сил на передней и задней осях, а коэффициент сопротивления воздуха в кузове седан равен 0,34, что соответствует уровню лучших мировых аналогов.

Во время краш-тестов, автомобиль Лада Приора, габаритные размеры которой достаточно невелики, в сравнении с авто её ценового сегмента, показала себя в лучшем виде: он соответствует последним европейским требованиям при боковом и фронтовом ударе. Абсолютная безопасность обеспечивается с помощью ремней безопасности для каждого пассажира, подушкой безопасности водителя, а в комплектации «люкс» еще и переднего пассажира.

Также в Приоре были улучшены боковые стойки, пороги пола, установлены стальные брусья безопасности дверей. В обивку дверей встроены специальные демпфирующие вставки, которые позволяют обеспечить повышенную безопасность при боковом ударе.

При возможном столкновении на невысоких скоростях, безопасность переднего пассажира увеличивается, благодаря мягкой накладке на панели приборов.

priorapro.ru

Лада Приора хэтчбек: технические характеристики и особенности модели

Перед покупкой любого авто будущий владелец внимательно изучает основные характеристики. Подбор транспортного средства в первую очередь выполняется по его мощности, экономичности, безопасности.

Весьма важны данные по новым модификациям привычных моделей. Например, для Лады Приора хэтчбек технические характеристики укажут на полученные обновления, доработку автомобиля и преимущества перед аналогами в другом кузове.

Габариты и динамические данные Приоры хэтчбек

Солидный хэтчбек имеет небольшие, но достаточные габариты: длина — 4,21 м, ширина — 1,68 м, высота — 1,43 м. Внутреннее пространство за счет незначительных внешних размеров было уменьшено, но минимально повлияло на комфорт поездок пассажиров второго ряда.

Незначительно отразились технические характеристики Приора хэтчбек и на объеме багажника. В седане объем багажного отделения равен 430 л, а в хэтчбеке составляет 360 л.

Оснащается модель бензиновыми моторами на 1,6 л. Комбинируется силовая установка с коробками механика или автомат на 5 ступеней. Мощность двигателей составляет 87, 98 и 106 л.с., максимально возможная скорость равняется 176 (183) км/ч. Указанные для Лада Приора технические характеристики хэтчбек приводят к следующему расходу топлива в смешанном режиме: от 6,6 до 7,3 л. Максимальный показатель относится к модели с автоматической коробкой.

Особенности эксплуатации Приоры хэтчбек

Важно перед покупкой авто дополнительно изучить внутренние особенности модели. Например, Лада Приора хэтчбек технические характеристики, которой являются довольно неплохими, имеет качественный иммобилайзер, маршрутный компьютер.

Оснащается модель электроусилителем руля, электроподъемниками стекол, обогревом наружных зеркал. К не менее важным установкам автомобиля можно считать:

1. Точную регулировку рулевого колеса по высоте.

2. Наличие передней подушки безопасности, системы экстренного торможения.

3. Современная климатическая установка и аудиосистема.

4. Корректор фар и дневные ходовые огни.

5. Сигнализация и центральный замок.

6. Качественная обтяжка сидений автомобильной тканью.

Приведенные технические характеристики Лада Приора хэтчбек и дополнения относятся к комплектации «норма». В базовой сборке многие из указанных особенностей комфорта и безопасности отсутствуют.

Стоимость обеих модификаций практически одинакова, поэтому при незначительной доплате можно получить качественный и надежный автомобиль. Последующая доработка базового авто может занять чересчур много времени, хотя по конечной цене и не будет отличаться.

Особо важными для отечественного авто являются небольшой расход и дешевое обслуживание. У современной модели ВАЗ Приора хэтчбек технические характеристики обеспечивают минимальные затраты на проведение диагностики и ремонта транспорта: поддерживать в полностью рабочем состоянии автомобиль не составит труда.

При необходимости можно провести доработку интерьера и экстерьера в зависимости от целей эксплуатации. В обычном виде может применяться и для проведения семейных поездок, и для ежедневных поездок на работу, и для безопасных путешествий.

priorapro.ru

габариты, размеры кузова, доступные двигатели и комплектации

Кузов
Дорожный просвет 165 мм
Объем багажника минимальный 430 л
Грузоподъёмность 393 кг
Полная масса 1578 кг
Снаряженная масса 1185 кг
Объем багажника максимальный 430 л
Колея задняя 1380 мм
Разрешённая масса автопоезда 2378 кг
Колея передняя 1410 мм
Ширина 1680 мм
Количество мест 5
Длина 4350 мм
Колёсная база 2492 мм
Высота 1420 мм
Двигатель
Мощность двигателя 106 л.с.
Обороты максимальной мощности до 5 800 об/мин
Максимальный крутящий момент 148 Н*м
Объем двигателя 1596 см3
Расположение цилиндров Рядный
Количество цилиндров 4
Количество клапанов на цилиндр 4
Тип двигателя Бензиновый
Обороты максимального крутящего момента 4200 об/мин
Тип впуска Распределенный впрыск
Трансмиссия и управление
Количество передач 5
Привод Передний
Тип КПП Робот
Эксплуатационные показатели
Максимальная скорость 183 км/ч
Разгон до 100 км/ч 11.4 сек
Расход топлива в городе на 100 км 8.5 л
Расход топлива на шоссе на 100 км 5.5 л
Расход топлива в смешанном цикле на 100 км 6.6 л
Объём топливного бака 43 л
Запас хода от 510 до 780 км
Экологический стандарт EURO IV
Марка топлива АИ-95
Подвеска и тормоза
Задние тормоза Барабанные
Передние тормоза Дисковые вентилируемые
Задняя подвеска Полузависимая, Гидравлический элемент, Рычажная, Амортизаторы, Пружинная
Передняя подвеска Независимая, Стойки МакФерсон, Пружинная, Стабилизатор поперечной устойчивости

wikidrive.ru

Лада Приора седан Фото. Характеристики. Размеры. Вес. Шины

В последнее десятилетие главным конкурентом ВАЗа стали корейские автомобили. И когда был представлена автомобиль Lada Priora, стиль его дизайна свидетельствовал: тольяттинские специалисты избрали азиатских производителей своими учителями. Priora очень напоминает корейскую продукцию. По сравнению с ВАЗ-2110 облик менее противоречив… и менее выразителен — большие фары неопределенной формы, скругленные грани, исчезли и оригинальные арки задних колес.

Лада Приора ВАЗ-2170 — видео тест драйв

Такая машина вполне соответствовала бы стилю Hyundai, KIA или Daewoo 10-летней давности. Главное преимущество корейских автомобилей — сочетание скромной цены и высокого качества. ВАЗ смог подтянуть качество. Швы между панелями кузова Priora в два раза меньше, чем у предыдущей модели, что говорит о более высокой культуре сборки и точности изготовления.Улучшилась пассивная безопасность. Появились подушки безопасности, ABS, EBD, жесткость кузова усилили, так что первые экземпляры Priora уже набирали две звезды в краш-тестах по методике Euro NCAP — больше, чем любая другая модель ВАЗа. Однако для продаж в Европе этого мало, и кузов усилили дополнительно, после чего автомобиль немного не дотянул до четырех звезд Euro NCAP (данные внутренних испытаний лаборатории ВАЗ).

В целом Priora получила около 950 изменений по сравнению с семейством ВАЗ-2110, было изменено около 2 тыс. деталей. Появился электроусилитель руля; двигатель прошел модернизацию, получив облегченную шатун-но-поршневую группу американской компании Federal-Mogul. Мощность повысилась на 10 %, а благодаря ряду импортных ключевых узлов (таких как ремень ГРМ) ресурс увеличился на 50 тыс. км. Усилили тормоза, для лучшей управляемости немного модифицировали подвеску. Следующим преимуществом корейских автомобилей была комплектация. Lada Priora — первый автомобиль ВАЗ, который практически не отстает от них. В списке опций базового оборудования — мультимедийная система с Bluetooth, парктроник, встроенный футляр для очков и другие элементы.В свое время корейские компании стали широко нанимать европейских конструкторов и дизайнеров, чтобы догнать японских и европейских производителей по эстетичности, управляемости и комфортабельности своих автомобилей. Пошел по этому пути и ВАЗ. Так, интерьер салона Priora разработан итальянским ателье Carcerano.

Выводя Priora на конвейер, ВАЗ отошел также от традиции постепенного вытеснения более старой модели. С началом выпуска Priora семейство ВАЗ-2110 было сразу снято с производства и передано для сборки по лицензии на другие заводы в России и Украине — как поступает большинство ведущих производителей. Priora находит определенный спрос в Европе. Журналисты хотя и не хвалят ее, критикуя вялые тормозные и разгонные характеристики и слабую (по европейским меркам) комплектацию и качество, но отдают машине должное: один из самых дешевых автомобилей на континенте является честным товаром.Усилия дали свой результат: сейчас продажи продукции Волжского автозавода вновь начали расти. Благодаря Priora завод вышел из кризиса, получил прибыль и нашел средства на самую глубокую модернизацию за последние десятилетия.

Технические характеристики Лада Приора

Тип кузова / количество дверей: седан / 4- Количество мест: 5

Двигатель Лада Приора

1.6 л 8-кл. (87 л.с.), 5МТ- Рабочий объем: 1596 см3- Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об. мин: 64 (87) / 5100- Максимальный крутящий момент, Нм / об. мин: 140 / 3800- Время разгона 0-100 км/ч, с: 12,5

1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5МТ- Рабочий объем: 1596 см3- Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об. мин: 78 (106) / 5800- Максимальный крутящий момент, Нм / об. мин: 148 / 4200- Время разгона 0-100 км/ч, с: 11,5

Расход топлива Лада Приора

Городской цикл, л/100 км: 8,9- Загородный цикл, л/100 км: 5,6- Смешанный цикл, л/100 км: 6,8

Максимальная скорость Лада Приора

176 км/ч с двигателем 1.6 л 8-кл. (87 л.с.), 5МТ- 183 км/ч с двигателем 1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5МТ

Габаритные размеры Лада Приора

Длина: 4350 мм- Ширина: 1680 мм- Высота: 1420 мм- База: 2492 мм- Колея передних / задних колес: 1410 / 1380 мм- Дорожный просвет: 165 мм

Объем багажника Лада Приора

430 литров

Объем бака Лада Приора

43 литров

Вес Лада Приора

Снаряженная масса, кг: 1163- Максимальная масса, кг: 1578

Грузоподъемность Лада Приора

Экологический класс Лада Приора

Размер шин Лада Приора

175/65/R14; 185/60/R14; 185/65/R14; 185/55/R15

Лада Приора ВАЗ-2170 фото тюнинга своими руками

Салон Лада Приора

Интерьер Лада Приора


ВАЗ Марш-1 (LADA-БРОНТО 1922-00) Фото Комплектации


Ока ВАЗ (СеАЗ, КамАЗ)-1111 Тюнинг Фото Двигатель Видео


ВАЗ-21099 Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-2121 / 2131 Нива Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


Лада Гранта Лифтбек Характеристики Двигатель Габаритные размеры Расход топлива Объем бака, багажника Грузоподъемность


Лада Веста Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-2120 Надежда Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


Лада Калина 2 хэтчбек Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-2109 Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-2107 Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-2103 Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-2108 Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


Шевроле Нива нового образца Двигатель Габаритные размеры Расход топлива


ВАЗ-2115 Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


Лада Гранта седан Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-2110 Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-2101 Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-2105 Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-212180 Фора Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-2104 Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-2112 Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-2111 Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-2102 Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива


ВАЗ-2106 Объем бака, багажника Грузоподъемность Расход топлива

Технические характеристики Лада Приора Хэтчбек 1.6 MT 98 лс. Лада приора хэтчбек объем багажника

  • универсал;
  • хэтчбек;
  • седан.
О багажнике Лада Приора седан

Объем багажника Лада Приора универсал в литрах: технические характеристики

Если человек задумался о покупке автомобиля Лада Приора, ему необходимо знать, что по техническим данным универсал мало чем отличается от автомобилей Приора в другом кузове. Однако именно вариант универсал может похвастаться яркими кузовными отличиями.

Автомобильный производитель АвтоВАЗ еще в 2013 году показал на авторынке новый вариант машины. Все новшества в основном затронули кузов. Он стал более практичным и вместительным. Вместе с этим изменения затронули дизайна зеркал и радиаторной решетки. На панели отображается больше информации. Также повышена безопасность автомобиля и внедрена система курсовой устойчивости.

В общем, инженеры провели немалую работу над новинкой, и сегодня такая модель получила еще большую популярность среди автолюбителей. В этой статье мы попробуем выяснить, какие изменения были внесены в объем багажника автомобиля Лада Приора универсал.

Кроме того, что в багажнике автомобиля Лада Приора можно перевезти достаточное количество груза, сложив задние сиденья, в машине появится место для уютного ночлега. Такой вариант Лады хорошо пригодится для любителей отдохнуть на природе с ночевкой, особенно когда температура воздуха еще не позволяет спать на улице. Ведь ночевать в просторном и удобном автомобиле лучше, нежели мерзнуть на свежем воздухе.

Размеры багажника авто Лада Приора универсал

Замеряя объем багажника автомобиля, можно заметить, что он составит 444 литра, а если сложить спинки задних сидений, то объем увеличивается до 777 литров.

В сравнении с моделью Лада Калина, отметим, не скажешь, что в новинке большой багажник, однако в него свободно вмещается небольшая кровать или коляска, велосипед.

Что касается технической стороны, в Ладе Приора универсал можно отметить и следующие характеристики:

  • проем двери, высота – 820 миллиметров;
  • высота от пола до крыши – 845 миллиметров;
  • ширина между колесными арками – 930 миллиметров;
  • длина со сложенными спинками – 164 сантиметра;
  • полная ширина – 150 сантиметров;
  • полная длина – 985 миллиметров;
  • от пола до полки – 560 миллиметров.

Задние сидения автомобиля крепятся таким механизмом, который не позволяет полностью сложить их в уровень пола багажника, а колесные арки забирают пространство в багажном отделении.

Лада Приора хэтчбек

К следующему сравнению возьмем автомобиль в кузове хэтчбек. В этой модификации объем багажного отделения составил 360 литров, а если сложить задние сиденья – приблизительно 750 литров. С учетом сложенных спинок в автомобиле реально уложить груз, длина которого 164-165 сантиметров, ширина – 850 миллиметров, высота – 800 миллиметров. Как говорится в технической документации, в багажник автомобиля можно размещать груз до 50 килограммов. Кроме багажника, отметим и другие параметры:

  • высота багажника – 523 миллиметра;
  • колесные арки, ширина – 930 миллиметров;
  • длина с разложенными задними сиденьями – 910 миллиметров;
  • длина при сложенных задних сиденьях – 170 сантиметров;
  • максимальная ширина – 150 сантиметров;
  • погрузочная высота – 720 миллиметров.

Что касается автомобиля Лада Приора в кузове седан, то объем багажника составляет 430 литров, однако сложить задние сиденья в данной модели невозможно.

Читайте также: Объем багажника Лада Приора седан

Из рассмотренных вариантов кузовов автомобиля Лада Приора можно сделать вывод, что самый большой багажник именно в модели универсал. Если вам важен размер данного отделения, то стоит обратить внимание именно на этот автомобиль.

В итоговом результате можно смело говорить, что автомобили от АвтоВАЗа, в частности модели Приора, довольно просторные и вместительные. У данной машины просторный и довольно презентабельный салон. На заводе-изготовителе постоянно происходят различные усовершенствования, искореняются все недочеты, которые могут не понравиться водителям.

В настоящее время от хозяев автомобилей Лада Приора поступают жалобы на громкий шум двигателя в салоне. Нам остается только ждать, пока инженеры устранят и эту проблему, сделав автомобиль еще просторнее и функциональнее.

На нашем сайте действует специальное предложение. Вы можете получить бесплатную консультацию нашего корпоративного юриста, просто задав свой вопрос в форме ниже.

Лада Приора — доступный объем багажника и различие комплектаций

Лада Приора представлена в нескольких кузовных вариантах — седан, универсал и хэтчбек. Автомобиль характеризуется простым и лаконичным дизайном экстерьера, а также консервативным стилем оформления внутренней части. Лада Приора, цвета кузова которой представлены широким ассортиментом, имеет пятиместное исполнение салона.

Двигатель и трансмиссия

Автомобиль оснащен 1,6-литровым 106-сильным бензиновым мотором. Силовая установка имеет рядную компоновку и оснащается четырьмя цилиндрами. Максимальный крутящий момент составляет 148 Нм. Дополнительно силовой агрегат оснащается опцией распределения впрыска топлива с электронным управлением. 106-силь

xn--44-6kchdmw3bgiawoo4b.xn--p1ai

Не кочегары мы, не плотники — журнал За рулем

С парой «монтажников-высотников» и их снаряжением испытывать универсалы «Лада-Калина» и «Лада-Приора» отправился Денис Арутюнян. Фото Георгия Садкова.

Складная лестница, ящик с гаечными ключами, коробка с проводами, поддон с мелким инструментом… Не хватает разве что монтерских кошек. Объемистая и довольно тяжелая поклажа перемещается в недра «Калины», а грузчики уже ворчат: все вроде хорошо — вместительности багажника хватает для большей части предметов, проем достаточно широк, нет риска врезаться головой в открытую дверь, однако переваливать тяжести через высокий бортик не очень удобно. Загрузили все? Нет, сколько ни вертели сложенную стремянку, впихнуть не смогли, для переносного генератора места тоже не осталось. Но есть возможность увеличить грузовой отсек, сложив задний диван.

Универсалы LADA Kalina, Priora

Не мелочились — убрали спинки целиком, а не по частям. Теперь другое дело: лестница влезла. Правда, легла она кривовато: спинка дивана хотя и не образует ступеньку, но выдается небольшим горбом. Ладно, главное, что взяли все — хоть отправляйся на самый сложный объект. Но не спешим: весь скарб придется перегружать в багажник «Приоры» — проверим и его возможности. За дело!

Универсалы LADA Kalina, Priora


Компактная «Калина» поражает грузовместимостью. Лестница хотя и с трудом, но вошла! Пробовать, влезет ли водокачка, не стали.

Высоким «высотникам» лучше пригнуться — здесь дверь висит чуть ближе к голове. Но гораздо важнее, что поднимать ящики легче: погрузочная высота меньше, а бортик вдвое ниже, чем в «Калине». Упаковались? А почему одна из коробок словно куда-то провалилась? Оказывается, боковые элементы фальшпола нависают над нишами в крыльях безо всякой опоры. Значит, тяжелый груз следует класть только посередине пола, над запаской. Так и сделали. И поняли: свободного места здесь больше. Правда, злополучные генератор с лестницей все же остались за бортом… Снова прибегнем к трансформации салонной «мебели».

Универсалы LADA Kalina, Priora

Тяжести в «Калину» можно загружать не нагибаясь — это плюс. А вот высокий порожек, через который приходится переваливать поклажу, — минус.

Тяжести в «Калину» можно загружать не нагибаясь — это плюс. А вот высокий порожек, ч

www.zr.ru

Объем багажника Лады Приора седан в литрах: технические характеристики

Инженеры Волжского автомобильного завода уловили тренд, и на сегодняшний день на предприятии предлагают новым автовладельцам машины в различных вариантах кузова. Не обошло и стороной внимание к автомобилям семейства Лада Приора. Покупая эту модель, человек обращает внимание не только на привлекательность этой машины, но и рассматривают технические характеристики и нюансы в дальнейшей эксплуатации.

К примеру, тяжело рассматривать автомобиль в кузове седан для перевозки различного багажа и грузов. Для таких целей рекомендуется эксплуатировать универсал, хэтчбек или караван. Однако множество потенциальных клиентов волнует вопрос о вместительности багажника в машине Лада Приора седан. Интерес покупателей к размерам багажного отделения вызван практическими и эксплуатационными соображениями.

Для справки: на автомобильном рынке Лада Приора представлена в таких вариантах кузовов:

  • универсал;
  • хэтчбек;
  • седан.

Читайте также: Как снять руль на Приоре с подушкой безопасности

О багажнике Лада Приора седан

Рассмотрим особенности в цифрах. По заявлению завода-изготовителя, такая характеристика, как объем багажника Лады Приора седан, расположилась между объемом данного отделения – универсал и хэтчбек. В технической документации указано, что объем багажника Приоры седан составляет 430 литров, что считается довольно удовлетворительным показателем для представителей такого класса.

Со стороны комфорта можно смело сказать, что, отправляясь в дорожное путешествие, в багажник седана без проблем реально упаковать большое количество груза, и это не отразится на комфорте пассажиров на задних местах.

Если покупателю объем багажника седана показался недостаточным, тогда сравним его с моделью данного семейства в кузове хэтчбек. Из технической документации видно, что объем багажника Лада Приора хэтчбек меньше, чем у того же автомобиля в исполнении седан, и составляет 306 литров. Но стоит учесть некие нюансы:

  • большая задняя дверь. За счет этого факта в багажнике автомобиля можно разместить груз большего объема, чем в седан;
  • если сложить спинки задних сидений, то в модели хэтчбек пространство для багажа существенно увеличится, приблизительно до 700 литров. Но это отразится на количестве пассажиров. В модели седан такие манипуляции невозможны.

Читайте также: Как снять передний бампер на Приоре

В автомобиле Лада Приора в исполнении хэтчбек без особых проблем можно перевезти даже стиральную машину, которую никак не удастся транспортировать в багажнике седана. Сложить спинки задних сидений не составит труда даже и ребенку, однако конструкция автомобиля не позволит такими манипуляциями добиться ровного пола в багажнике. Из минусов такого решения следует отметить и тот факт, что большое пространство багажного отделения в хэтчбеке отнимают колесные арки. Однако это не мешает посоревноваться автомобилю в рейтинге объемов багажника данного семейства.

Читайте также: Как на Приоре отключить АБС

Что касается самых вместительных детищ АвтоВАЗа семейства Приора, так это автомобили в исполнении кузова универсал. Эта линейка может гордо похвастаться вместительностью в 444 литра. Кроме того, конструкция универсала позволяет сложить спинки задних сидений, что позволяет расширить багажный отсек до внушительных 777 литров объема. Отправляясь за город на автомобиле Приора универсал, благодаря большой задней двери этого представителя, в него можно загрузить крупногабаритные грузы, и даже использовать багажник для комфортного ночлега.

На нашем сайте действует специальное предложение. Вы можете получить бесплатную консультацию нашего корпоративного юриста, просто задав свой вопрос в форме ниже.

ladaautos.ru

Объем багажника Лада Приора седан в литрах: размеры

В России традиционно популярными являются автомобили с кузовом седан. Впрочем, здесь многое зависит от личных вкусовых пристрастий. По сравнению с советским периодом, выбор на автомобильном рынке существенно увеличился, и сегодня каждый может подобрать себе наиболее оптимальный вариант – как по цене, так и по внешнему виду.

На Волжском автомобильном заводе уловили тренд, и сегодня предприятие предлагает потенциальным покупателям свою продукцию в разных вариантах кузова. Не является здесь исключением и семейство Приора. Приобретая данную модель, потенциальные покупатели зачастую руководствуются не только лишь своими симпатиями, но и учитывают особенности дальнейшей эксплуатации.

Например, для перевозки грузов седан трудно назвать самым оптимальным вариантом. Для этого больше подходит универсал, или, как его еще называют, караван либо хэтчбек. Тем не менее многих интересует, каков объем багажника автомобиля Приора с кузовом седан. Зачастую это не праздное любопытство. Такой интерес во многих случаях вызван практическими соображениями.

По объему багажника седан расположился между хэтчбеком и универсалом

Напомним, что на рынке данное семейство представлено в трех разных кузовах:

  • седан;
  • хэтчбек;
  • универсал.

Теперь давайте обратимся к цифрам. Согласно данным завода-изготовителя, багажник Приоры с кузовом седан по такому показателю, как объем, можно поставить между хэтчбеком и универсалом. Его объем составляет 430 литров. Это весьма неплохой показатель для автомобилей данного класса.

Иными словами, отправляясь в дорогу, вы сможете прихватить с собой солидный запас вещей, никак не ущемив в плане комфорта пассажиров, в том числе и сидящих на задних сиденьях.

Наименее вместительным является багажник хэтчбека. Его объем, согласно данным завода-изготовителя, уступает седану и составляет лишь 306 литров. Однако здесь есть два очень важных момента. Во-первых, большая задняя дверь позволяет загрузить в автомобиль гораздо объемнее груз, чем можно расположить в багажнике седана.

Помимо этого, при сложенных задних сиденьях объем багажного пространства Приоры с кузовом хэтчбек увеличивается до очень приличных 705 литров. Согласитесь, здесь вполне можно разместить, например, стиральную машину, которую при всем желании невозможно запихнуть в седан. Складывается заднее сиденье довольно просто, однако конструкторы так и не сумели предложить решение, позволяющее укладывать его вровень с полом. Кроме того, немного багажного пространства отнимают колесные арки. Тем не менее цифры, по сравнению с другими одноклассниками, достаточно приличные.

Ну а наиболее вместительным в семействе Приора является, конечно же, модель с кузовом универсал. Объем багажника здесь составляет 444 литра. Естественно, задние сиденья также можно сложить. В таком случае объем багажного отсека увеличивается до 777 литров. Добавьте сюда большую заднюю дверь – и вы получите наиболее оптимальный вариант для перевозки различных грузов, в том числе и достаточно объемных, среди всех автомобилей Приора.

Как видим, седан при прочих равных условиях практически не уступает универсалу по такому показателю, как объем багажника в литрах. При этом он еще и существенно опережает хэтчбек. Но стоит сложить задние сиденья, как картина полностью меняется. Лидерство уверенно продолжает удерживать универсал, тогда как хэтчбек уже опережает седан.

Выбирая себе Приору, этот момент также стоит учитывать. Если вы не собираетесь часто перевозить объемные грузы, то вам вполне подойдет и седан. Если же планируется относительно регулярная перевозка, например, доставка товаров по магазинам, то следует обратить внимание на более вместительный универсал. Автомобили семейства Приора зарекомендовали себя как очень хороший вариант за свою цену. Они обладают неплохой динамикой, являясь при этом достаточно экономичными, уверенно держат дорогу, да и езда здесь более комфортная, чем на ВАЗ «десятой» серии.

Стоит обратить внимание на дорожный просвет (клиренс) – 165 мм и ширину колеи передних колес и задних – 1410 и 1380 мм, соответственно. В багажник может уместиться около 430 литров груза.

По количеству расходуемого топлива – что седан, что хэтчбек – практически одинаковы.

Хэтчбек

Универсал


На сегодняшний день выпускаются три вида кузовов: седан, хэтчбек и универсал. Так как про первые два вы уже знаете все, расскажем вам про универсал. Это очень практичная машина, вместительно багажное отделение дает возможность перевозить большие грузы, а также вы можете без труда трансформировать заднее сиденье в кровать.

Если посмотреть с технической точки зрения на этот вид кузова, то объем его составляет 444 литра, а при сложенном диване – около 800 литров (до уровня окон).

Характеристика объема багажника универсал (мм):

  • ширина – 1500, между арками колес – 930;
  • длина – 985 и 1640 при сложенном диване;
  • расстояние от пола до полки багажника составляет 560, а до крышки – 845;
  • размер проема багажной двери – 820.

У самой же машины с кузовом универсал весьма серьезные габариты (мм):

  • в длину составляет 4340;
  • в ширину – 1680;
  • в высоту – 1508;
  • дорожный просвет – 170.

Лада Приора представлена в нескольких кузовных вариантах — седан, универсал и хэтчбек. Автомобиль характеризуется простым и лаконичным дизайном экстерьера, а также консервативным стилем оформления внутренней части. Лада Приора, цвета кузова которой представлены широким ассортиментом, имеет пятиместное исполнение салона.

Двигатель и трансмиссия

Автомобиль оснащен 1,6-литровым 106-сильным бензиновым мотором. Силовая установка имеет рядную компоновку и оснащается четырьмя цилиндрами. Максимальный крутящий момент составляет 148 Нм. Дополнительно силовой агрегат оснащается опцией распределения впрыска топлива с электронным управлением. 106-сильный мотор управляется пятиступенчатым автоматом или механической коробкой с идентичным количеством ступеней. Большой объем багажника Приоры хэтчбека и достаточно мощный двигатель позволяет использовать автомобиль для семейных поездок.

Лада Приора разгоняется до сотни за 12,6 с и может набрать скорость до 183 км/ч. При учете относительно небольшой массы, уровень потребления топлива транспортного средства варьируется в пределах 5,5-8,8 л на каждые 100 км пути.

Технические характеристики

Удобная конструкция подвески и достаточный объем багажника Приоры седан позволяет использовать автомобиль в качестве подходящей модели для регулярных командировочных поездок. В передней части расположены стойки McPherson. Сзади подвеска имеет зависимое исполнение.

Лада Приора, дорожный просвет которой составляет 165 мм, имеет спереди дисковые вентилируемые тормоза. В задней части тормозная система имеет барабанное исполнение. В целом это положительно сказывается на уровне безопасности при эксплуатации. Система рулевого управления в автомобилях начальной комплектации оснащена гидравлическим усилителем. Более дорогие версии Приоры отличаются наличием электромеханического усилителя рулевого управления.
Передняя часть автомобиля идентична у всех модификаций модели, соответственно и капот на Ладу Приору установлен одинаковый, как на седане, так и на универсале.

Отличия комплектаций

Вне зависимости от кузовного исполнения, автомобиль оснащается системой переднего привода. Объем багажника Приора (универсал) составляет 444 литра. При условии демонтажа заднего ряда сидений этот показатель может увеличиться до 777 литров.

Базовое исполнение автомобиля (комплектация – Стандарт) включает в себя иммобилайзер, подушку безопасности для водителя и аудиоподготовку.
Комфортабельный салон обшит тканевыми материалами, которые легко поддаются чистке. Стандартная модификация автомобиля также отличается наличием атермального остекления, которое характеризуется повышенным коэффициентом теплопоглощения.

Существует модификация автомобиля, которая наиболее привлекательна для владельцев модели Приора — комплектация «Норма». Что входит в оснащение такого транспортного средства, мы рассмотрим дальше. Разработчики оснастили эту версию автомобиля подушкой безопасности, полным электропакетом и центральным замком. Особенностью данной модификации является небольшой лючок, предусмотренный в заднем сиденье для упрощения транспортировки грузов большой длины. Такое конструктивное решение актуально для версии Лады Приоры в кузовном исполнении седана.

Топовая версия автомобиля (Люкс) имеет самое дорогое оснащение. Потенциальные покупатели могут рассчитывать на модель с улучшенной обивкой салона и системой круиз-контроля. Вся информация о работе системы выводится на сенсорный дисплей. В комплектации Люкс автомобиль оснащен опцией подогрева передних кресел, литыми колесными дисками и задними подголовниками. Такой уровень оснащения позволяет легко преодолевать большие отрезки пути.

В России традиционно популярными являются автомобили с кузовом седан. Впрочем, здесь многое зависит от личных вкусовых пристрастий. По сравнению с советским периодом, выбор на автомобильном рынке существенно увеличился, и сегодня каждый может подобрать себе наиболее оптимальный вариант – как по цене, так и по внешнему виду.

На Волжском автомобильном заводе уловили тренд, и сегодня предприятие предлагает потенциальным покупателям свою продукцию в разных вариантах кузова. Не является здесь исключением и семейство Приора. Приобретая данную модель, потенциальные покупатели зачастую руководствуются не только лишь своими симпатиями, но и учитывают особенности дальнейшей эксплуатации.

Например, для перевозки грузов седан трудно назвать самым оптимальным вариантом. Для этого больше подходит универсал, или, как его еще называют, караван либо хэтчбек. Тем не менее многих интересует, каков объем багажника автомобиля Приора с кузовом седан. Зачастую это не праздное любопытство. Такой интерес во многих случаях вызван практическими соображениями.

По объему багажника седан расположился между хэтчбеком и универсалом

Напомним, что на рынке данное семейство представлено в трех разных кузовах:

  • седан;
  • хэтчбек;
  • универсал.

Теперь давайте обратимся к цифрам. Согласно данным завода-изготовителя, багажник Приоры с кузовом седан по такому показателю, как объем, можно поставить между хэтчбеком и универсалом. Его объем составляет 430 литров. Это весьма неплохой показатель для автомобилей данного класса.

Иными словами, отправляясь в дорогу, вы сможете прихватить с собой солидный запас вещей, никак не ущемив в плане комфорта пассажиров, в том числе и сидящих на задних сиденьях.


Наименее вместительным является багажник хэтчбека. Его объем, согласно данным завода-изготовителя, уступает седану и составляет лишь 306 литров. Однако здесь есть два очень важных момента. Во-первых, большая задняя дверь позволяет загрузить в автомобиль гораздо объемнее груз, чем можно расположить в багажнике седана.

Помимо этого, при сложенных задних сиденьях объем багажного пространства Приоры с кузовом хэтчбек увеличивается до очень приличных 705 литров. Согласитесь, здесь вполне можно разместить, например, стиральную машину, которую при всем желании невозможно запихнуть в седан. Складывается заднее сиденье довольно просто, однако конструкторы так и не сумели предложить решение, позволяющее укладывать его вровень с полом. Кроме того, немного багажного пространства отнимают колесные арки. Тем не менее цифры, по сравнению с другими одноклассниками, достаточно приличные.

Ну а наиболее вместительным в семействе Приора является, конечно же, модель с кузовом универсал. Объем багажника здесь составляет 444 литра. Естественно, задние сиденья также можно сложить. В таком случае объем багажного отсека увеличивается до 777 литров. Добавьте сюда большую заднюю дверь – и вы получите наиболее оптимальный вариант для перевозки различных грузов, в том числе и достаточно объемных, среди всех автомобилей Приора.

Как видим, седан при прочих равных условиях практически не уступает универсалу по такому показателю, как объем багажника в литрах. При этом он еще и существенно опережает хэтчбек. Но стоит сложить задние сиденья, как картина полностью меняется. Лидерство уверенно продолжает удерживать универсал, тогда как хэтчбек уже опережает седан.

Выбирая себе Приору, этот момент также стоит учитывать. Если вы не собираетесь часто перевозить объемные грузы, то вам вполне подойдет и седан. Если же планируется относительно регулярная перевозка, например, доставка товаров по магазинам, то следует обратить внимание на более вместительный универсал. Автомобили семейства Приора зарекомендовали себя как очень хороший вариант за свою цену. Они обладают неплохой динамикой, являясь при этом достаточно экономичными, уверенно держат дорогу, да и езда здесь более комфортная, чем на ВАЗ «десятой» серии.

Лада Приора технические характеристики ТТХ: размеры и масса, узлы


Основные характеристики

МаркаВАЗ
МодельЛада Приора Хэтчбек
МодификацияЛада Приора Хэтчбек 1.6 MT 98 лс
Модельный год2013
Тип кузоваХэтчбек
Количество дверей5
Количество мест5
Страна сборкиРоссия

Эксплуатационные характеристики

Вид топливаАИ-95
Время разгона до 100 км/ч11.5 сек
Максимальная скорость183 км/ч
Расход топлива в городском цикле9.1 л на 100 км
Расход топлива на трассе5.5 л на 100 км
Расход топлива в смешанном цикле6.9 л на 100 км
Запас хода473 – 782 км
Расходы на топливо в год (при пробеге 100 км в день)119 629₽
Транспортный налог * (Москва)1 176₽
ОСАГО * (Москва, возраст свыше 22 лет, стаж более 3 лет)7 570₽

* Воспользуйтесь калькуляторами Налога и ОСАГО для более детального расчета.

Габариты и размеры

Длина4210 мм
Ширина1680 мм
Высота1435 мм
Дорожный просвет165 мм
Колея передняя1410 мм
Колея задняя1380 мм
Колесная база2492 мм
Диаметр разворота11.6 м

Масса

Снаряженная масса1163 кг
Полная масса1578 кг
Грузоподъемность415 кг

Объемы

Объем багажника360 л
Объем топливного бака43 л

Двигатель

Тип двигателяБензиновый
Число цилиндров / расположение4/Рядный
Мощность двигателя, л.с / оборотах98/5600
Рабочий объем двигателя1596 см³
Крутящий момент, Н·м / оборотах145/4000

Трансмиссия

ПриводПередний
Тип коробки передачМеханическая, 5 передач

Кузов

Модификации Лада Приора

Лада Приора 1.6 AMT

Максимальная скорость, км/ч183
Время разгона до 100 км/ч, сек11.4
ДвигательБензиновый
Рабочий объем, см31596
Мощность, л.с. / оборотах106/5800
Момент, Н·м / оборотах148/4200
Расход комби, л на 100 км6.6
Тип коробки передачРоботизированная, 5 передач
ПриводПередний

Лада Приора 1.6 MT

Максимальная скорость, км/ч176
Время разгона до 100 км/ч, сек12.5
ДвигательБензиновый
Рабочий объем, см31596
Мощность, л.с. / оборотах87/5100
Момент, Н·м / оборотах140/3800
Расход комби, л на 100 км7.0
Тип коробки передачМеханическая, 5 передач
ПриводПередний

Лада Приора 1.6 MT 106 лс

Максимальная скорость, км/ч183
Время разгона до 100 км/ч, сек11.5
ДвигательБензиновый
Рабочий объем, см31596
Мощность, л.с. / оборотах106/5800
Момент, Н·м / оборотах148/4200
Расход комби, л на 100 км6.9
Тип коробки передачМеханическая, 5 передач
ПриводПередний

Лада Приора 1.6 MT 98 лс

Максимальная скорость, км/ч183
Время разгона до 100 км/ч, сек11.5
ДвигательБензиновый
Рабочий объем, см31596
Мощность, л.с. / оборотах98/5600
Момент, Н·м / оборотах145/4000
Расход комби, л на 100 км6.9
Тип коробки передачМеханическая, 5 передач
ПриводПередний

Технические характеристики Лада Приора универсал

Размеры у Приоры универсал, после рестайлинга, немного изменились за счет новых бамперов. Так ранее длина автомобиля составляла 4 330 мм, сейчас 4 340 мм. Стоит так же отметить, что дорожный просвет или клиренс Lada Priora в кузове универсал больше, чем у седана и хэтчбека на 5 мм и равен 170 мм. Такая разница объясняется усиленной подвеской, поскольку универсал предназначен не только для перевозки пассажиров, но и для перевозки всевозможных грузов. В частности задние пружины автомобиля имеют больше витков. Высота автомобиля так же больше, если сравнивать с собратьями по семейству. Большого секрета здесь нет, просто на всех универсалах Lada Priora штатно стоят рейлинги на крыше. Смотрим подробные габаритные размеры Приора универсал ниже.

Габариты, клиренс, багажник Лада Приора универсал

  • Длина – 4340 мм
  • Ширина – 1680 мм
  • Высота – 1508 мм
  • Снаряженная масса/ полная масса – 1185 / 1593 кг
  • Колея передних колес/задних – 1410 / 1380 мм
  • База, расстояние между передней и задней осью – 2492 мм
  • Объем багажника – 444 литров
  • Объем багажника при сложенных сидениях – 777 литров
  • Объем топливного бака – 43 литров
  • Размер шин – 175/65 R14 или 185/60 R14 или 185/65 R14
  • Клиренс универсала Лада Приора – 170 мм

Что касается силовых агрегатов, то здесь как и в случае с хэтчбеком и седаном имеется два двигателя на выбор, это мотор ВАЗ-21126 мощностью 98 л.с. и более продвинутая модификация с пассивным наддувом ВАЗ-21127 мощностью 106 л.с. Однако неофициально двигатель ВАЗ-21127 выдает немного больше лошадок. Оба мотора имеют 4 цилиндра и 16 клапанов, два распредвала которые приводятся в движение посредством ремня. Далее параметры этих моторов.

Характеристики двигателя ВАЗ-21126 16 кл. МКПП5-ст.

  • Рабочий объем – 1596 см3
  • Мощность л.с/кВт – 98/72 при 5600 оборотах в минуту
  • Крутящий момент – 145 Нм при 4000 оборотах в минуту
  • Расход топлива в смешанном цикле – 6,9 литра

Характеристики двигателя ВАЗ-21127 16 кл. МКПП5-ст.

  • Рабочий объем – 1596 см3
  • Количество цилиндров/клапанов – 4/16
  • Мощность л.с/кВт – 106/78 при 5800 оборотах в минуту
  • Крутящий момент – 148 Нм при 4200 оборотах в минуту
  • Максимальная скорость – 183 километров в час
  • Разгон до первой сотни – 11,5 секунд
  • Расход топлива в смешанном цикле – 6,8 литра

Особенности двигателя

Двигатель «Лады Приоры» устроен просто и надежно, поэтому нечасто нуждается в ремонте. Прочный чугунный блок цилиндров и проходящий между ними хладагент составляют основу конструкции. Головка блока цилиндров сделана из алюминия, на ней находятся клапаны. Поршни мотора также сделаны из алюминия. Их дно оформлено специальными канавками, которые защищают двигатель от серьезных повреждений в случае поломки или аварии. Поликлиновый ГРМ надежно закреплен и защищен от соскальзывания. Для этого с одной стороны ремень ограничен пояском, а с другой – специальной шайбой.

На двигатель «Приоры» 126-й серии были поставлены абсолютно новые поршни, которые разработаны компанией Federal Mogul. Их масса на 30 % меньше, чем у ВАЗ-2110. На каждом поршне имеется три кольца, поверхности которых защищены оловянным напылением. Все эти нововведения позволяют продлить срок эксплуатации деталей и снизить издержки на их ремонт. Чугунный коленвал обладает увеличившимся ходом поршня – в новой модели он составляет 94 мм. Клапаны двигателя «Приоры» сделаны из жаропрочного материала и могут поворачиваться во время работы, поэтому обладают меньшим износом.

Размеры кузова и масса автомобиля Лада Приора — хэтчбэк, универсал, седан, купе, лонг

Идеальная машина для каждого своя – все зависит от того, зачем ее покупают. Приора отлично подходит, как для молодого поколения, так и для старшего. Вес который она может поднять, различается – так, универсал получил объемный багажник, который способен вместить больше вещей. Ширина Приоры остается неизменной – ровно 164 см. Вес машины колеблется от 1578 до 1598 кг.

Хэтчбек

Когда речь заходит про габаритные размеры, Лада Приора не может не радовать – с ней можно проехать даже по самому узкому двору. Снаряженная масса хэтчбека – 1163 кг, максимально допустимая – 1578 кг. Объем багажника – 360 л, а с разложенными сиденьями – 705 л. Высота равна 143,5 см, длина – 421 см.

Седан

Габариты седана немного отличаются, но масса автомобиля остается неизменной. Объем багажника при это равен 430 л. Размеры кузова седана составляют 142 см в высоту, длина равна 435 см.

Универсал

Улучшенные технические характеристики Лада Приора универсал разрешают серьезно нагружать багажник – об усиленной подвеске заранее позаботились. В отличие от хэтчбека у универсала длина на 13 см больше – 434 см. Высота составляет 150,8 см. Объем багажника равен 444 л и 777 л при разложенных сиденьях. Полная масса может быть равна 1598 кг.

Купе

Трехдверный хэтчбек Lada Priora выпускался в спортивной версии и отличался улучшенными характеристиками – после рестайлинга под его капотом оказалось 123 лошади. Кузовные элементы пришлось переделать, что не так сильно сказалось на габаритах. Длина равна 424,3 см, высота 143,5 см.

Лонг кузов

Удлиненная Приора – это версия «Премьер», премиальная. Ее базу удлинили на 17,5 см, сделали заднюю дверь больше, а в стекло добавили дополнительную секцию. Под капотом появилось заметное преимущество – нужно больше «лошадей», чтобы тащить более тяжелую машину. Салон отделан изысканно и стильно. Ширина осталось той же – 168 см, длина равна 452,5 см, а высота – 142 см. Снаряженная масса равна 1100 кг, а объем багажника остался прежним – 430 л.

Декор пластиковых компонентов

Ниссан жук 2011 технические характеристики, комплектации и цены
Седан укомплектован массой деталей из пластмассы в интерьере, благо многие из них имеют светлые тона и легко перекрашиваются. Процесс покраски пластика из аэрозольного баллончика требует наличия не только респиратора и перчаток, но и обезжиривающей жидкости и грунтовки

Во время работы важно не допускать образование потеков

Другой способ усовершенствовать внешний вид пластиковых элементов – обтянуть их пленкой «карбон». По заверениям многих автолюбителей этот материал долговечен и эффектно смотрится. Заготовки режутся с запасом по краям в 20-25 мм, после чего пленка наклеивается на обезжиренную поверхность. Края и изгибы обрабатываются феном, чтобы предотвратить изломы и загибы.

Рестайлинг Лада Приора 2013 года

Рестайлинг 2013 года заключался в некоторых изменениях, касающихся внешнего вида, кое-какого оборудования, интерьера и двигателя. В числе таких изменений у Приор мы назовем:

  • Несколько измененную экстерьерную геометрию, которую, впрочем, нет смысла описывать, поскольку визуально Приора до и после рестайлинга внешне осталась почти неразличимой;
  • Замену решетки радиатора на вытянутые «соты», немного склоняющие автомобиль в модный ныне «органический» стиль, характерный биологическими формами;
  • Улучшенную внешнюю светотехнику, благодаря которой габариты автомобиля стали отчетливее в темное время. В частности увеличена площадь светоотражателей, добавлены светодиодные секции габаритов и стоп-сигналов, которые и ярче, и острее реагируют на включение;
  • Приборную панель, которая реализована иначе: вместо четырех «циферблатов» стрелки датчиков удалось скомпоновать в двух, без ущерба для функционала. Чисто эстетически это выглядит лучше, а с эргономической точки зрения многое зависит от привычки;
  • Увеличенное число пиктограмм, вспыхивающих на приборной доске, благодаря чему проще разобраться в том, какая светотехника засбоила;
  • Добавленную нишу в центре торпедо, в которую помещен бортовой компьютер;
  • Удлиненные салазки передних сидений, благодаря чему высокий водитель и передний пассажир могут настраивать положение кресел под себя более гибким образом;
  • Более вместительный по глубине бокс справа от водителя;
  • Более привлекательное трехспицевое рулевое колесо с подушкой безопасности под треугольной крышкой;
  • В «люксовой» комплектации – обивку кожи на основе комбинации автоткани с экокожей;
  • Новый дизайн дверных карт.

Также с 2013 года Приоры выпускаются в другой двигательной комплектации, из которой убрали 80-сильный, но зато добавили новый двигатель на 106 л/с, который, как и все, развивает скорость до 183 км/ч, и сокращает расход топлива до 6,8 – 6,9 литра на каждую сотню км. Этим двигателем оснащаются «люксовые» комплектации Приоры. Конечно, такое уменьшение расхода топлива очень привлекает потребителя. Остается надеяться, что разработчики будут и дальше трудиться в этом направлении. Кроме того, новый двигатель хорошо вписался в экологические нормативы Euro-3 и Euro-4, благодаря близко расположенному катализатору. За счет быстрого нагрева катализация токсичных веществ происходит бодрее, в результате чего в атмосферу попадает уже меньшая их концентрация.

Есть у рестайлинговых Приор и недостаток (по сравнению с прежними выпусками этого автомобиля): ковер в багажнике тоньше, чем у предшественниц, из-за чего уровень шума во время движения выше. Автомобилистам рекомендуется позаботиться о дополнительной шумоизоляции багажника. Кроме того, снаряженный вес автомобиля увеличился, (до 1185 кг), что на целых 100 кг. сократило его грузовые возможности, поскольку максимальная масса осталась прежней – 1593 кг. для универсала, и 1578 кг. для прочих кузовных вариаций.

Внутреннее оформление

Что касается салона, рестайлинг не совершил революции, и в целом новая Приора немногим отличается от привычной, но некоторые особенности все же есть:

  • Приборная панель стала более информативной, добавились новые элементы. Был использован более качественный пластик, изменен дизайн самой доски, она стала выглядеть значительно привлекательнее, чем раньше.
  • Если приобретать максимальную комплектацию, все кнопки управления будут на месте, однако при использовании базовой версии автомобиля на приборной панели будет много заглушек, наблюдать их понравится не всем, однако сама панель стандартна, поэтому при желании купленную Приору потом можно дополнить нужным оборудованием, и кнопки будет куда поставить.
  • Кресла не стали шире, поэтому если вы обладаете крупной комплекцией, возможно, сидеть будет не очень удобно. Передние сиденья имеют несколько настроек, регулируются они ручным приводом.
  • Улучшилось качество обивки салона, однако используется достаточно грубая ткань. Это сделано с целью увеличить ее износостойкость, при этом не повышая цену автомобиля.
  • Качество сборки вряд ли порадует, не стоит пугаться посторонних скрипов или больших неравномерных зазоров. Пластик не везде прилегает плотно, местами может скрипеть. Все детали пластиковые, никаких вставок из алюминия или дерева не предусмотрено даже в типовой комплектации.
  • Регулировать задние кресла нельзя, стоит заметить, что сзади места довольно мало, и сидеть не очень удобно, если вы обладатель высокого роста.
  • Зато шумоизоляция автомобиля стала намного лучше, работу двигателя и шум от шин почти не слышно.

Характеристики подвески

Ходовая часть Приоры была создана для спокойного проезда по ухабам и препятствиям, а также проезда по проселочной дороге. Конечно, ВАЗ-2170 – это не внедорожник, но она легко пройдет по многим местам. Передняя часть подвески является независимой, а задняя – полузависимой, за счет чего получается сделать машину мягче.

Рычаги стабилизатора поперечной устойчивости вместе со стойками многие владельцы, почти сразу меняют на спортивный комплект – для того, чтобы машина не шаталась, когда выполняется резкий поворот. Телескопические амортизаторы стабильно гасят колебания при проезде препятствий, так что проблем с ней не возникнет. ВАЗ-2170 – переднеприводная машина.

  • Передняя подвеска по типу МакФерсон с продольными растяжками.
  • Задняя подвеска также с продольными рычагами. В ней установлена поперечная балка U-образного сечения, к которой крепится стабилизатор поперечной устойчивости торсионного типа.

Что касается дорожного просвета, для дорестайлинговой версии он составлял 165 мм, а для рестайлинговой – 170 мм. Колесная база равна 249,2 см, ширина передней колеи – 141 см, задней – 138 см. Подвеску можно занизить или завысить при желании – готовые комплекты для модернизации есть в открытой продаже.

Перемена цвета

Мерседес в-класс 2011 технические характеристики, комплектации и цены

«Первые впечатления: машину нужно раскатывать, не едет. Шумоизоляции нет, замки, ручки дверей требуют доработки. Штатная резина шумная и дубовая. Едешь как на пеньках».

«За два нелегких месяца автомобиль прошел 18 000 км, но никаких проблем не доставил. Ходовая, на мой взгляд, вполне терпимая, единственное — в правой стойке при прохождении „лежачих полицейских“ раздается стук. Приехал на сервис, посмотрели — все нормально, говорят, это у них болезнь такая. Тормоза неплохие, на четверку»…

Сравниваю впечатления московских владельцев «Приор» со своими. У машин одинаковые 98-сильные моторы, потому в движении кардинальных различий нет. Подвески исправно глотают крупные кочки, но на мелких неровностях потряхивает. Однако серый автомобиль интереснее на уровне нюансов: собраннее в поворотах, чуть стабильнее на выходе, мягче глотает дорожные неровности.

Тормозная система

Тормоза спереди и сзади отличаются. Спереди установлены дисковые вентилируемые тормоза с однопоршневым плавающим суппортом и авторегулировкой зазора между колодками и диском, а сзади – барабанные тормоза. Тормозная система диагональная двухконтурная, гидравлическая. Оснащается вакуумным усилителем.

Возможна работа с антипробуксовочной системой. Также сзади можно самостоятельно установить дисковые тормоза вместо штатных барабанных. Новая тормозная система также будет поддерживать работу ABS. Стояночный тормоз ручной, на тросике с приводом задних колес.

Варианты исполнения «Приоры» универсал

Для «Лады Приоры» универсал возможны три варианта комплектации:

  1. «Стандарт» — самая дешёвая (не выпускается с 2014 года).
  2. «Норма», в которой предусмотрены подушка безопасности для водителя, система тормозов с вакуумным усилителем, дисковые передние тормоза, усилитель рулевого управления, инерционные ремни безопасности, противоугонная сигнализация, ходовые огни для светлого времени суток, тканевый салон, электропривод обогреваемых наружных зеркал.
  3. «Лада Приора» универсал «Люкс» отличается тем, что в ней есть подушки безопасности для пассажирских сидений первого ряда, датчик дождя, электростеклоподъёмники в задних дверях, литые диски. Отделочный материал салона — алкантара (искусственная замша). Положение передних сидений можно регулировать. В некоторых случаях «Лада Приора» универсал «Люкс» оснащена парктрониками и навигатором.

В 2013 году прошёл рестайлинг автомобиля. Внешне универсал 2013 года и универсал 2014 года мало отличаются. На новом варианте появились обновлённая решётка радиатора, подворотники на боковых зеркалах, изменились передний и задний бамперы, а в фонарях были установлены светодиоды.

Салон «Приоры» универсал 2013 года претерпел серьёзные изменения. Он был модернизирован при участии итальянской дизайн-студии Carcerano. Автомобиль теперь оснащается трехспицевым рулём, в центральной консоли устанавливается цветной монитор для управления стереосистемой и отражения информации навигатора. В старших комплектациях сиденья переднего ряда оснащаются дополнительными подушками безопасности и регулируемым подогревом.

Кузов и компоновка автомобиля

Тип кузова ВАЗ 2171 — пятиместный пятидверный универсал. Пятая дверь цельная, открывается вверх. Габаритные характеристики «Лада-Приора» универсал (длина кузова, ширина и высота) составляют 4210, 1680 и 1420 мм соответственно. Высота указана с учётом рейлингов, которые не снимаются. Для автомобиля «Лада-Приора» универсал предлагаются 10 вариантов цвета кузова: от чёрного и тёмно-красного до белого и серебристого. «Лада-Приора» универсал цвета «снежная королева» больше всего подходит для южных районов, поскольку меньше нагревается от солнца. Летом в автомобили такого цвета будет не так жарко.

База автомобиля (расстояние между передней и задней осями) составляет 2492 мм. Передняя колея — 1410 мм, задняя несколько больше, ее размер равен 1380 мм. Клиренс (или дорожный просвет) составляет 170 мм. Багажник универсала Priora имеет объем 444 кубических дм, а при сложенных сидениях заднего ряда объем возрастёт до 777 кубических дм, но в ровный пол сидения не складываются. «Лада Приора 2171» имеет переднеприводную компоновочную схему с передним поперечным расположением двигателя. Колёсная формула — 4×2 (автомобиль имеет 4 колеса, из которых 2 являются ведущими).

В линейке моделей АвтоВАЗа «Лада Приора» универсал ближе всего к универсалу «Калина». Что лучше: «Калина» универсал или «Приора» универсал, точно определить нельзя. «Калина» на 30 см короче, и багажник у неё на 30 л меньше. Но «Приору» уже не выпускают, поэтому купить абсолютно новый автомобиль невозможно, как и провести тест-драйв «Лада-Приора» универсал в автосалоне.

Lada Priora Special Edition — фото и комплектация

Российский автогигант — АвтоВАЗ недавно выпустил с конвейера «пилотную» партию обновленной комплектации автомобиля Лада Приора. «Рестайлинговой» Приоре присвоили индекс SE — т.е. «Special Edition». В этой пробной серии не так много машин, и все они предназначены для испытаний и демонстраций. Запуск производства первой серии Priora SE планируется в 2011 году.

Отличительной особенностью новой модели Приора SE является передний бампер нового поколения, соответствующий европейским требованиям и нормам безопасности, в случае наезда на пешехода.

Стоит напомнить, что Lada Priora SE уже представлялась однажды на ММАС-2010. Но с тех пор было внесено еще несколько существенных изменений. Например, в зеркала заднего вида были встроены «поворотники», а гнезда на крыльях были закрыты заглушками с индексом «SE», разработанными специально для этой цели. Тормозную систему в обновленной модели оборудовали ABS и Brake Assist – системой, которая позволяет намного эффективнее выполнять мгновенное торможение, тогда, когда водитель недостаточно сильно нажимает на педаль.

В планах создателей так же установка навигации ГЛОНАСС/GPS, которая будет интегрирована в аудиосистему. Изображение будет не только выводиться на спец. дисплей, но и озвучиваться. Предполагается, что во время голосовых подсказок музыка в салоне будет приглушаться, а переключить режим навигации можно будет с помощью джойстика, расположенного под рулем.

Еще одна особенность Lada Priora SE – это электронная система управления двигателем, со специальной программой, управляющей электронной педалью газа. Не будет новостью, что при использовании этой системы двигатель даже в морозы, и при повышенной влажности, прогревается и запускается гораздо быстрее, к тому же топливо расходуется значительно экономнее.

Нельзя не заметить, что в салоне будут предусмотрены новые варианты обивок для сидений, и более удобные подголовники на задних сиденьях.

Предназначена Lada Priora SE в основном, для тех стран, в которых требования к машинам по безопасности и экологичности особенно серьезны. В России же эта комплектация будет предлагаться как «топовая» (цена пока не озвучена).

Силовой агрегат автомобиля

Возможны три варианта двигателя:

  • 8-клапанный движок ВАЗ-2116, имеющий мощность 90 лошадиных сил;
  • 16-клапанный мотор ВАЗ-21126 мощностью 98 лошадиных сил. Модификация универсала с двигателем 21126 (заводское обозначение ВАЗ 217130) — самая доступная на вторичном рынке;
  • 16-клапанный двигатель ВАЗ-21127, выдающий мощность в 106 лошадиных сил, выигрывает по параметрам экономичности и надёжности.

Базовым двигателем модели «Лада Приора 2171» является бензиновый, четырёхтактный, четырёхцилиндровый (цилиндры расположены в ряд) 16-клапанный двигатель ВАЗ-21127 с распределённым впрыском. Этот двигатель появился после доработки мотора ВАЗ-21126 в части улучшения системы впуска. На ВАЗ 21127 вместо одного датчика массового расхода воздуха установлены два: абсолютного давления и температуры воздуха. Это позволило избавиться от известной проблемы предыдущей модели — колебаний частоты вращения коленвала на малых оборотах.

Объем этого мотора — 1596 кубических см, диаметр каждого из четырёх цилиндров — 82 мм, ход поршня — 75,6 мм, степень сжатия — 11. Октановое число используемого бензина — 95. Этот мотор развивает мощность до 106 лошадиных сил при скорости вращения коленчатого вала 5800 об./мин, а его максимальный крутящий момент составляет 148 Нм при 4200 об./мин. Очевидно, что характеристики ВАЗ «Приора» с двигателем 21127 на 8 лошадиных сил и на 3 Нм выше, чем у автомобиля той же марки с движком 21126.

Предельная скорость «Приоры» универсал с двигателем 21127 составляет 183 км/час, разгон до сотни возможен за 11,5 с при полной массе 1578 кг. Расход топлива в смешанном цикле — 6,8 л на 100 км, а на трассе расход топлива составляет 5,4 л на 100 км. Топливный бак вмещает 43 л горючего. Производитель заявляет ресурс двигателя в 200 тыс. км.

Предлагаем обзор самого практичного автомобиля из всего семейства Lada Priora. Это конечно же новая Лада Приора универсал (ВАЗ 2171). В нашей статье вы найдете фото, характеристики, цены и другую информацию об этом автомобиле.

Первые Приоры в кузове универсал появились в продаже еще в 2009 году, через два года после старта продаж седанов. Lada Priora универсал самый просторный и вместительный автомобиль из всего семейства Приор. Однако по длине универсал на 1 сантиметр короче седана, но длиннее хэтчбека. При этом, колесная база у всех трех вариантов кузова одинакова.

Объем багажного отделения универсала Priora 444 литра, однако если сложить задние сидения, то объем погрузочного пространства возрастает до 777 литров. Самое интересное, что в идеально ровный пол сидения все таки не складываются.

Что касается последнего рестайлинга, который прошел в 2013 году, то автомобиль внешне практически не изменился. Не считая новой решетки радиатора, бамперов, поворотников встроенных в наружные зеркала и оптики с дневными ходовыми огнями, кстати в задних фонарях теперь стоят светодиоды.

Однако техническая часть и салон подверглись более серьезным изменениям. Так на Лада Приора универсал нового поколения появился более мощный силовой агрегат в 106 л.с. Этот двигатель не новая разработка, а модернизированный мотор мощностью 98 л.с. Что касается трансмиссии переднеприводного универсала, то конструкторы “Автоваза” доработали механическую коробку, появился новый тросовой привод сцепления. Автоматического варианта трансмиссии пока нет, но как обещает производитель Лада Приора с АКПП встанет на конвейер в конце лета 2014 года. Кроме всего шумоизоляция Lada Priora универсал немного улучшена.

Но первое, что явно бросается в глаза на новой Приоре, это салон. Появились новые сидения с более практичной и приятной на ощупь тканью. Кстати, в богатых комплектациях в передние сидения встроены боковые подушки безопасности и подогрев с тремя уровнями мощности. Руль теперь стал трехспицевым. Центральная консоль имеет цветной монитор, который не только является элементом стерео системы, но и может выступать в роли экрана навигатора.

Почему троит двигатель

Из часто встречающихся поломок данного силового агрегата отмечается такие дефекты, как неустойчивая работа и троение мотора. Подобные отказы происходят вследствие появления неисправностей в узлах и деталях двигателя:

  • снижение давления топлива;
  • дефекты элементов газораспределительного механизма;
  • сбои в работе датчиков;
  • нарушение герметичности в шлангах;
  • неисправная дроссельная заслонка.

Мощность силового агрегата снижается по следующим причинам:

  • низкая компрессия в одном или нескольких цилиндрах;
  • прогорание прокладок;
  • износ стенок цилиндров;
  • стирание колец поршневых;
  • деформация поршней под воздействием высоких температур.

Троение движка можно устранить при помощи промывки форсунок. Причины нестабильной работы силового агрегата могут крыться в неисправности следующих устройств:

  • свечи для Приоры 16 клапанов;
  • катушка зажигания;
  • заслонка дроссельная;
  • регулятор холостого хода;
  • аккумулятор;
  • стартер;
  • катушка зажигания;
  • бензонасос;
  • топливный фильтр;
  • регулирующее устройство давления топлива.

Свечи на Приору можно заменить самостоятельно. Для этого необходимо ознакомиться с принципами правильного выбора и замены данных узлов, описанными в специальных статьях в интернете.

Технические характеристики Лада Приора седан 1.6 литра 8v 5-мкпп

Мощность мотора80 л.с.
Крутящий момент120 Нм
Разгон до 100 км/ч12.5 с
Макс. скорость172 км/ч
Тип топливаАИ-95
Расход в городе9.8 л
Расход по трассе5.8 л
Смешанный расход7.6 л
Объем бака43 л
Объем багажника430 л

На сколько хватает бензобака

С максимальным наполнением объема бензобака Лада Приора, питаясь АИ-95 (по паспорту!) проедет:

  • 438 км по городу;
  • 767 км по трассе;
  • 597 км в смешанном цикле.

Однако, дальность езды на полном баке приводится нами по грубой прикидке, поскольку в зависимости от комплектации и модификации она может несколько изменяться, хотя во всех случаях объем бензобака один и тот же: 43 литра.

Лада Приора технические характеристики ТТХ: размеры и масса, узлы


Лада Приора стала приемником ВАЗ-2110, переняв от нее несколько элементов и получив симпатию отечественных автовладельцев — куда же мы без тазов. Около 400 деталей было переделано. В своем сегменте Лада Приора получает одну из лучших оценок благодаря своей неприхотливости и хорошим показателям. Но что точно стоит сказать о машине, технические характеристики автомобиля Приора вполне приличны для своего класса.

АвтоВАЗ представил модель ВАЗ-2170 в середине нулевых годов, Приора выпускалась с 2007 по 2022 годы, а в 2013 году претерпела рестайлинг с небольшими изменениями. За все время было выпущено большое количество автомобилей ВАЗ, появилось немало идей по улучшению и стилизации машин Лада Приора. Технические характеристики это тот момент по которому опытный водитель выбирает себе машину, не за красивые глаза же ее брать. Хотя посмотрите на рисунок ниже и на ее глаза.

ТТХ двигателя автомобиля Приора: 126 и 127 сколько лошадиных сил и крутящего момента

Технические характеристики мотора автомобиля Приора показывают на борту 98 и 106 лошадиных сил. Это касается моторов с рабочим объемом 1,6 л.

  • Мотор — 98 лошадиных сил получил номер 21126. Максимальный крутящий момент– 4000 об/мин при 145 Нм.
  • Мотор — 106 лошадиных сил значится под номером 21127, крутящий момент – 4 200 об/мин при 148 Км.

Мотор 21127 является модифицированной версией 126 модели, но оба они выпускаются шестнадцатиклапанными. Кроме этого на Приоре есть два восьмиклапанных мотора рабочим объемом 1,6 л, которые выдают 81 и 87 л.с., но они не так распространены, как более новые версии. Что интересно, есть моторы с объемом 1,8 л.

  1. Первый мотор 1,8 л выдает мощность 98 л.с. (также работает 21127), но при этом крутящий момент равен 3000 об/мин при 160 Нм.
  2. Мотор со 123 л.с., который ставился на спортивные версии, выдает 4000 об/мин при 165 Нм.

В сопоставлении с весом автомобиля, шестнадцатиклапанных двигателей достаточно для свободного передвижения.

Что касается технического состояния, ВАЗ-21126 и последующие модели превосходят восьмиклапанные версии движков, поэтому автовладельцы их выбирают чаще. К самой распространенной «компоновке» можно отнести Приору седан с двигателем 21126 и механической коробкой передач.

Двигатель лада приора 2008, хэтчбек, 1 поколение

5-дверные хэтчбеки выпускаются с 2008 года. В зависимости от комплектации они оснащаются:

  • 80-сильным 8-клапанным двигателем, выдающим те же скоростные и расходные характеристики, что и в случае с седаном, снабженным тем же мотором;
  • 16-клапанным двигателем на 89 л.с., выдающим для хэтчбека ту же скорость и расходуя то же количество бензина, что и седан с таким же самым мотором;
  • 98-сильным 16-клапанным мотором, благодаря которому хэтчбек полностью совпадает по скоростным и расходным характеристикам с седаном с той же силовой установкой.

Характеристики(ТТХ): коробки передач Приоры

Приора комплектуется двумя коробками передач:

  1. механическая;
  2. роботизированная.

Пятиступенчатая МКПП всегда стабильна. Задача владельца – следить за ней и давать ей должный уход, не уповая на то, что машина «починится сама». Передаточные числа таковы, что заставляют машину с шестнадатиклапанными двигателями достигать «сотни» всего за 11 секунд.

Роботизированная АКПП также идет с пятью ступенями. Она является небольшой доработкой старой надежной японской коробки Jatco. По заявлению автоВАЗа, в разгоне не уступает машинам с МКПП. Могут возникнуть ошибки вроде пинков при разгоне. Убираются при помощи перепрограммирования ЭБУ. Сцепление сухое однодисковое, внутри – диафрагменная нажимная пружина. Привод выключения сцепления тросовый с авторегулировкой.

Продажи и перспективы

Спрос на Приору стабильно растёт уже не первый год, и вполне закономерно бывшая в 2010 году второй по продажам, по итогам 2012 г. Приора становится первой.

К осени 2013 г. планируется появление обновленных автомобилей ВАЗ Приора, причём обновления коснутся в первую очередь внешнего вида как салона, так и наружных элементов. Запланировано также производство автомобилей Приора в комплектации с ESC, боковыми подушками безопасности, мультимедийной системой, климат-контролем и предпусковым подогревателем, но срок выпуска таких автомобилей пока не называется. Вообще же АатоВАЗ планирует продавать Приоры до 2016 г. включительно.

Размеры кузова и масса автомобиля Лада Приора — хэтчбэк, универсал, седан, купе, лонг

Идеальная машина для каждого своя – все зависит от того, зачем ее покупают. Приора отлично подходит, как для молодого поколения, так и для старшего. Вес который она может поднять, различается – так, универсал получил объемный багажник, который способен вместить больше вещей. Ширина Приоры остается неизменной – ровно 164 см. Вес машины колеблется от 1578 до 1598 кг.

Хэтчбек

Когда речь заходит про габаритные размеры, Лада Приора не может не радовать – с ней можно проехать даже по самому узкому двору. Снаряженная масса хэтчбека – 1163 кг, максимально допустимая – 1578 кг. Объем багажника – 360 л, а с разложенными сиденьями – 705 л. Высота равна 143,5 см, длина – 421 см.

Седан

Габариты седана немного отличаются, но масса автомобиля остается неизменной. Объем багажника при это равен 430 л. Размеры кузова седана составляют 142 см в высоту, длина равна 435 см.

Универсал

Улучшенные технические характеристики Лада Приора универсал разрешают серьезно нагружать багажник – об усиленной подвеске заранее позаботились. В отличие от хэтчбека у универсала длина на 13 см больше – 434 см. Высота составляет 150,8 см. Объем багажника равен 444 л и 777 л при разложенных сиденьях. Полная масса может быть равна 1598 кг.

Купе

Трехдверный хэтчбек Lada Priora выпускался в спортивной версии и отличался улучшенными характеристиками – после рестайлинга под его капотом оказалось 123 лошади. Кузовные элементы пришлось переделать, что не так сильно сказалось на габаритах. Длина равна 424,3 см, высота 143,5 см.

Лонг кузов

Удлиненная Приора – это версия «Премьер», премиальная. Ее базу удлинили на 17,5 см, сделали заднюю дверь больше, а в стекло добавили дополнительную секцию. Под капотом появилось заметное преимущество – нужно больше «лошадей», чтобы тащить более тяжелую машину. Салон отделан изысканно и стильно. Ширина осталось той же – 168 см, длина равна 452,5 см, а высота – 142 см. Снаряженная масса равна 1100 кг, а объем багажника остался прежним – 430 л.

Грузовместимость

Грузовая вместимость (не грузоподъемность!) Приор варьируется в зависимости от типа кузова. Так, багажники имеют разные объемы:

  • 360 литров – у хэтчбека и купе;
  • 430 литров – у седана;
  • 444 литра – у универсала.

Как мы видим, этот объем не сильно отличается от седановского, поэтому говорить о том, что Приора-универсал создана для решения широкого ряда хозяйственных задач (относительно других вариантов этого авто), можно с очень большой натяжкой.Конечно, грузовместимость существенно увеличивается, если сложить спинку заднего дивана, а еще лучше – снять полностью заднее сиденье.

Характеристики подвески

Ходовая часть Приоры была создана для спокойного проезда по ухабам и препятствиям, а также проезда по проселочной дороге. Конечно, ВАЗ-2170 – это не внедорожник, но она легко пройдет по многим местам. Передняя часть подвески является независимой, а задняя – полузависимой, за счет чего получается сделать машину мягче.

Рычаги стабилизатора поперечной устойчивости вместе со стойками многие владельцы, почти сразу меняют на спортивный комплект – для того, чтобы машина не шаталась, когда выполняется резкий поворот. Телескопические амортизаторы стабильно гасят колебания при проезде препятствий, так что проблем с ней не возникнет. ВАЗ-2170 – переднеприводная машина.

  • Передняя подвеска по типу МакФерсон с продольными растяжками.
  • Задняя подвеска также с продольными рычагами. В ней установлена поперечная балка U-образного сечения, к которой крепится стабилизатор поперечной устойчивости торсионного типа.

Что касается дорожного просвета, для дорестайлинговой версии он составлял 165 мм, а для рестайлинговой – 170 мм. Колесная база равна 249,2 см, ширина передней колеи – 141 см, задней – 138 см. Подвеску можно занизить или завысить при желании – готовые комплекты для модернизации есть в открытой продаже.

Рестайлинг

В 2013 году в Тольятти была презентована обновленная версия Lada Priora. Стоит отметить, что уже до официального дебюта в сети появились картинки, видео новинки.

С точки зрения дизайна экстерьера машина не претерпела существенных изменений. Реформы незначительно коснулись бамперов, решетки радиатора, молдингов. А вот, задняя оптика освещения обзавелась светодиодными лампами, которые дают более яркий свет в сравнении с обычными, к тому же более долговечны.

Внутреннее убранство выглядит современней за счет иной компоновки панели приборов, а также экрана мультимедийной системы. На центральной консоли исчезли аналоговые хронометры, а на их место пришла вещевая ниша.

Тормозная система

Тормоза спереди и сзади отличаются. Спереди установлены дисковые вентилируемые тормоза с однопоршневым плавающим суппортом и авторегулировкой зазора между колодками и диском, а сзади – барабанные тормоза. Тормозная система диагональная двухконтурная, гидравлическая. Оснащается вакуумным усилителем.

Возможна работа с антипробуксовочной системой. Также сзади можно самостоятельно установить дисковые тормоза вместо штатных барабанных. Новая тормозная система также будет поддерживать работу ABS. Стояночный тормоз ручной, на тросике с приводом задних колес.

Новое авто на старой платформе

Десятая модель начала производится в конце 90-х годов. Инженеры «АвтоВАЗа» уже тогда хорошо понимали, что на базе платформы, разработанной еще в 90-е, ничего перспективного построить не удастся, и очень скоро автомобиль станет невостребованным. Что самое страшное – его без особого труда обойдут зарубежные конкуренты с бюджетными моделями. Первоочередной задачей специалистов «АвтоВАЗа» стал рестайлинг. Кстати, внешний видом автомобиля дизайнеры начали заниматься еще задолго до того, как модель поставили на конвейерную сборку. Посмотрите, как выглядит предсерийный ВАЗ-217030. Фото автомобиля можно увидеть ниже.


В результате всех изменений потребители получили совершенно новый и более комфортабельный автомобиль, который полностью соответствовал стандартам рынка на тот момент. Уже в базовой комплектации «Приора» была оснащена всеми необходимыми опциями. Машина комплектовалась подушками безопасности, электрическими стеклоподъемниками на передних дверях, электрическим усилителем рулевого управления, центральным замком и многими другими элементами.

Резюме

В остальном же все детали полностью отрабатывают свой срок без нареканий. Естественно, из всех правил бывают исключения и есть много автомобилей с разными проблемами. Но что касается первых поколений, их не стоит покупать на вторичном рынке. Качество сборки откровенно «хромает». Если соблюдать правила эксплуатации и правильно обслуживать автомобиль, то он прослужит своему владельцу довольно долго. Сегодня эти машины продаются на вторичном рынке – можно купить в хорошем состоянии ВАЗ-217030. Инструкция к автомобилю расскажет владельцу о правильной эксплуатации.

Итак, мы выяснили, какие имеет «Лада Приора» технические характеристики, дизайн и интерьер.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Усовершенствованная нормализация FRET позволяет проводить количественный анализ белковых взаимодействий, включая стехиометрию и относительную аффинность в живых клетках. Банк данных, содержащий их, доступен в Интернете по адресу http://www.meduniwien.ac.at/user/johannes.schmid/. Используемые плазмиды и карты перечислены на дополнительном рисунке 11.

Подготовка образцов клеток

Все эксперименты проводились на клетках HeLa, клон ACC 57.Клетки пассировали за сутки до трансфекции, достигая конфлюэнтности 70–80% в день трансфекции. Для микроскопических экспериментов клетки высевали на 8-луночные предметные стекла со стеклянным дном иди. Для проточной цитометрии клетки высевали в 24-луночные многолуночные планшеты. Для охвата широкого диапазона соотношений акцептор/донор плазмиды, несущие донор или акцептор, трансфицировали в пяти различных массовых соотношениях: 5:1, 3:1, 1:1, 1:3 и 1:5. Трансфекцию осуществляли с помощью реагента для трансфекции TurboFect™ (Thermo Scientific™, каталожный номер: R0531) в соответствии со спецификациями продукта.

Получение и оценка изображений под микроскопом

Микроскопию выполняли на лазерной сканирующей конфокальной системе Nikon A1 R+, оснащенной 12-разрядными детекторами, с использованием план-апохроматического масляного иммерсионного объектива с увеличением 60x (NA1.4). Донорный канал был получен с возбуждением на 488 нм и эмиссионным фильтром 525/50. Канал FRET был получен с возбуждением на 488 нм и эмиссионным фильтром 595/50. Акцепторный канал был получен с возбуждением на 561 нм и эмиссионным фильтром 595/50.

Измерения фотообесцвечивания акцептора были выполнены на Nikon A1 с использованием план-апохроматического масляного иммерсионного объектива с увеличением 60x (NA1.4). Фотодеструкцию применяли при длине волны 561 нм при 100% мощности лазера в течение одной секунды (лазер: Melles Griot 85-YCA-020, мощность 20 мВт при 561 нм ± 0,5 нм).

Оценка изображений проводилась с использованием пакета программного обеспечения Fiji ImageJ (https://fiji.sc/) и набора самописных макросов FRET, которые находятся в свободном доступе под лицензией GPLv3 (стандартная общественная лицензия версии 3). ) на GitHub под (https://github.com/BHochreiter). Предоставляется описание и протокол использования этих макросов для оценки (дополнительный рис.7).

Получение и оценка методом проточной цитометрии

Измерения FRET на основе проточной цитометрии проводились на приборе CYTOFLEX S (Beckman Coulter, серийный номер AW19039) с использованием следующих настроек каналов. Донорский канал: лазерное возбуждение 488 нм, 525/40 Фильтр излучения BP (505–545 нм), канал FRET: лазерное возбуждение 488 нм, фильтр излучения BP 610/20 (600–620 нм), акцепторный канал: возбуждение лазером 561 нм, фильтр излучения 610/20 BP (600–620 нм

Программное обеспечение CytExpert (https://www.beckman.com/coulter-flow-cytometers/software) использовали для сбора данных и гейтирования анализируемых популяций. Программное обеспечение FlowPy (http://flowpy.wikidot.com/) использовалось для извлечения данных из файла формата FCS в формат txt с разделителями табуляции.

Оценка обесцвечивания акцептора

В качестве альтернативного метода определения эффективности FRET мы использовали метод фотообесцвечивания акцептора, в котором используется прямое сравнение интенсивности излучения донора до и после фотодеструкции акцепторного флуорофора, после чего большинство измерений и инструментов вызванные искажения не имеют значения, и поэтому результат является прямым коррелятом физического процесса.Однако многие флуорофоры проявляют определенные спектральные аномалии при освещении сильным источником света, которые необходимо учитывать перед анализом FRET. Донорные флуорофоры иногда могут совместно обесцвечиваться или, наоборот, фотоактивироваться при освещении с определенной длиной волны акцептора, что приводит к изменению флуоресцентного сигнала без присутствия FRET. Другим явлением является фотопереключение акцептора после обесцвечивания, когда вместо потери излучения акцептор переходит на другой профиль излучения, который часто можно обнаружить в донорном канале 12,13 .

Поправочные коэффициенты df (совместное обесцвечивание и фотоактивация донора) и af (фотопереключение акцептора) используются для учета этих эффектов и определяются для образцов, содержащих только донор или акцептор.

$$df=\frac{{D}_{dpost}-{D}_{dpre}}{{D}_{dpre}}$$

(2)

$$af=\frac{{D}_{apost}-{D}_{apre}}{{A}_{apre}-{A}_{apost}}$$

(3)

, где «после» означает интенсивность после обесцвечивания с акцептор-специфическим возбуждением, а «до» — значение до.{c}}$$

(5)

Расчет коэффициентов нормализации C1 и C2

Сигналы доноров, FRET и акцепторов требуют нормализации, чтобы преобразовать их в одно измерение и сделать возможным расчет относительных концентраций и соотношений доноров и акцепторов. C1 и C2 нормализуют донор или акцептор соответственно к сигналу в канале FRET. Им требуется информация от конструкции с известной эффективностью переноса и стехиометрией. Каждый измеренный эксперимент включал популяцию, трансфицированную тандемной слитой конструкцией mCherry-YFP, которая удовлетворяет этим требованиям.{c}\ast C2}$$

(8)

Расчет различных показателей FRET по полученным сигналам

Из-за спектральных свойств флуорофоров сигналы донора, акцептора и канала FRET необходимо скорректировать на спектральные перекрестные помехи (или просачивание) от другого флуорофора. Во-первых, четыре фактора спектрального просачивания определяются с использованием образцов, содержащих только донорный или акцепторный флуорофор. В литературе можно найти различные номенклатуры для этих факторов — в этой работе используются S1–S4 31 .S1 и S3 описывают спектральное просачивание донорной флуоресценции в FRET и акцепторный канал соответственно, тогда как S2 и S4 описывают спектральное просачивание акцепторной флуоресценции в FRET и донорный канал соответственно. (Список математических параметров в уравнениях приведен в таблице 1)

$${\rm{донор}}\,{\rm{into}}\,{\rm{FRET}}\,{\rm{ канал}}:{S}_{1}=\frac{{F}_{d}}{{D}_{d}}$$

(9)

$${\rm{акцептор}}\,{\rm{в}}\,{\rm{FRET}}\,{\rm{канал}}:{S}_{2}=\frac{ {F}_{a}}{{A}_{a}}$$

(10)

$${\rm{донор}}\,{\rm{в}}\,{\rm{акцептор}}\,{\rm{канал}}:{S}_{3}=\frac{ {A}_{d}}{{D}_{d}}$$

(11)

$${\rm{акцептор}}\,{\rm{в}}\,{\rm{донор}}\,{\rm{канал}}:{S}_{4}=\frac{ {D}_{a}}{{A}_{a}}$$

(12)

Таблица 1 Список переменных.{c}=\frac{{A}_{da}-{S}_{3}\ast {D}_{da}}{1-{S}_{3}\ast {S}_{4 }}$$

(14)

Если донор не дает никакого сигнала в акцепторном канале и наоборот, т.е. S3 и S4 равны 0, то этот шаг можно пропустить, а использовать сигналы сразу после коррекции фона.

Скорректированные сигналы донора и акцептора можно использовать для отделения реального FRET-сигнала от спектрального просачивания в FRET-канале согласно Youvan et al .{c}}$$

(18)

Моделирование экспериментов FRET

Для моделирования экспериментов FRET мы создали математическую модель, основанную на обобщенной форме закона действующих масс, которая описывает состояние всех химических взаимодействий в равновесии.

$$A+B\rightleftharpoons \text{AB},\,{K}_{a}=\frac{[AB]}{[A]\ast [B]}$$

(19)

Состояние равновесия, а точнее, концентрации свободной и связанной фракций молекул зависят от концентраций реагентов, а также их сродства, описываемого константой сродства K a (или ее обратной величиной, константа диссоциации K d ).K a — постоянная величина для реакции при заданной температуре и давлении. Для расчета FRET мы можем использовать наши донор и акцептор как A и B соответственно.{c}\) и F c сигналы могут быть рассчитаны путем применения фиксированное значение для максимальной эффективности FRET FRET max , которое представляет собой эффективность FRET, если все донорные и акцепторные молекулы были вовлечены в донорно-акцепторный комплекс, а также коэффициенты спектрального просачивания S1, S2, S3 и S4.

$${D}_{da}={[don]}_{free}+[complex]\ast (1-FRE{T}_{max})+({[acc]}_{free} +[комплекс])\ast {S}_{4}$$

(26)

$${A}_{da}={[acc]}_{свободный}+[сложный]+(\,{[don]}_{свободный}+[сложный]\ast (1-FRE{T }_{макс.}))\ast {S}_{3}$$

(27)

$${F}_{da}=[комплекс]\ast FRE{T}_{max}+S1\ast {D}_{da}+S2\ast {A}_{da}$$

(28)

Для вычислительного моделирования модель можно упростить, установив S1, S2, S3 и S4 на 0, что не меняет математического моделирования.

Из полученных значений были рассчитаны показатели FRET в соответствии с уравнениями 16–18.

Подгонка результатов FRET

встроили результаты наших измерений в имитационную модель. Чтобы напрямую использовать интенсивности донорного и акцепторного каналов, а также полученный DFRET для подгонки, мы немного изменили формулу, чтобы получить меру FRET вместо концентрации комплекса.{app}}\ast \frac{FRE{T}_{max}}{don}$$

(31)

Аппроксимация проводилась с помощью нелинейной модели наименьших квадратов, сводящей к минимуму отклонение теоретических и реальных значений за несколько итераций. Подгонка модели может быть непосредственно применена к измеренным значениям, но должна быть ограничена значимой областью вокруг стехиометрии комплекса. Для простого взаимодействия 1:1 мы применяем модель ко всем значениям с отношением акцептора к донору от 0,2 до 2.

Статистическая информация

Статистические значения для подгонки модели были определены с помощью нелинейного алгоритма подбора методом наименьших квадратов программного обеспечения R. Статистическая информация (где применимо) и n чисел приведены на соответствующих рисунках или в подписях к рисункам.

Реализованное программное обеспечение и код

Все описанные расчеты и оценки могут быть выполнены в свободно доступных ( R, ImageJ, CytExpert, FlowPy ) или распространенных (Microsoft Excel) программных пакетах.

Расчеты FRET, оценка FRET и моделирование были выполнены в Microsoft Excel (версия 2013). Предоставляются примеры таблиц данных (дополнительные шаблоны 1 и 2), включая пояснения по использованию и набор образцов данных (дополнительные рисунки 8–10).

Подбор модели был выполнен в R (https://www.r-project.org/) с использованием команд нелинейного подбора методом наименьших квадратов. Предоставляется код, используемый для установки (дополнительное примечание 2).

Весь написанный код, который использовался в этой работе, включая полностью автоматизированные макросы ImageJ и последовательности кода R, предоставляется в дополнении или доступен на Github по адресу https://github.com/BHochreiter.

Межмолекулярный FRET-сенсор определяет динамику кластеризации Т-клеточных рецепторов

CliF проявлял усиленный FRET при высокой плотности

красный флуоресцентный белок mCherry. Чтобы избежать изменений внутримолекулярной эффективности FRET из-за гибкости дипольного выравнивания, мы удалили 11 аминокислот с С-конца Venus и 7 аминокислот с N-конца mCherry и ограничили линкер между двумя флуоресцентными белками только серин-глицин.С этого момента мы называем эту конструкцию CliF. Мы объединили CliF с мембранным якорем (Lck10, первые 10 аминокислот Lck) 27 , который нацеливает белок на плазматическую мембрану (рис. 1а, б). Ожидается, что при высоких уровнях экспрессии сенсора FRET также будет происходить между донорами и акцепторами соседних сенсоров, то есть доноры на одной молекуле будут FRET с акцепторами на соседней молекуле. Действительно, в трансфицированных клетках HeLa клетки с более высоким уровнем экспрессии белка Lck10-CliF постоянно имели более короткое время жизни флуоресценции донора по сравнению с клетками с более низкой экспрессией (рис.1б). Когда мы построили график времени жизни донора CliF в зависимости от общей клеточной флуоресценции (как меры концентрации белка), мы обнаружили сильную отрицательную корреляцию ( R 2 = 0,866), которую можно было подогнать к линии с наклоном — 0,075. Мы сконструировали контрольную конструкцию Lck10-Venus, которая содержала только донора, слитого с тем же якорем мембраны. С этой конструкцией время жизни Венеры практически не зависело от экспрессии белка ( R 2 = 0,886, наклон -0.0039, рис. 1в). Напротив, совместная экспрессия Lck10-Venus с mCherry-H-Ras11 (mCherry, слитая с последними 11 аминокислотами H-Ras) в той же клетке в равных количествах (с использованием пептида 2A) приводила к линейной корреляции с наклон -0,021 ( R 2 = 0,925, рис. 1c), что указывает на то, что присутствие mCherry-H-Ras11 при высокой плотности привело к FRET с Lck10-Venus. Величина изменения эффективности FRET в зависимости от концентрации акцептора качественно соответствует теоретической структуре невзаимодействующих белков в мембранах, описанной ранее 28,29 .Эти данные убедительно указывают на то, что сокращение времени жизни Венеры в Lck10-CliF было вызвано межмолекулярным FRET при высокой плотности. Примечательно, что время жизни Venus CliF было в три раза более чувствительным к уровню экспрессии, чем коэкспрессия Lck10-Venus и mCherry-H-Ras11, что подчеркивает преимущество наличия акцепторного и донорного флуорофора на одном и том же белке.

Рисунок 1: Lck10-CliF чувствителен к концентрации мембранного белка.

( a ) Схематическое изображение CliF, слитого с мембранным якорем (Lck10): одноцепочечная пара FRET Venus-mCherry может проявлять только внутримолекулярный FRET в виде мономера (слева), а также межмолекулярный FRET в белковых кластерах (справа) .( b ) Интенсивность флуоресценции (слева) и изображение средней продолжительности жизни донора (справа) клеток HeLa, экспрессирующих Lck10-CliF. Значения времени жизни псевдоокрашены в соответствии с цветовой шкалой. Масштабная линейка, 10  мкм. ( c ) Продолжительность жизни Венеры в Lck10-CliF (синий), только Lck10-Венера (черный) и Lck10-Венера, коэкспрессированная с mCherry-H-Ras11 (зеленый), как функция общей (донорной + акцепторной) интенсивности. Каждый набор данных был подогнан к прямой линии (красные линии), что дало наклоны -0,075 ( R 2 =0.866), -0,0039 ( R 2 =0,886) и -0,021 ( R 2 =0,925) для Lck10-CliF, Lck10-Venus и коэкспрессированных Lck10-Ras1, mCherry-H соответственно. ( d f ) Доли времени жизни Венеры как функция общей (донорно-акцепторной) интенсивности для Lck10-CliF ( d ), Lck10-Венера ( e ) и совместно экспрессируемых Lck10-Венера и mCherry-H-Ras11 ( f ). Доли времени жизни были извлечены путем подгонки гистограмм времени жизни Венеры к трехкомпонентной экспоненциальной функции распада, что привело к трем различным значениям времени жизни, как указано.Данные в c f были получены по крайней мере для 30 клеток на условие. В экспериментах FLIM было зарегистрировано более 200 фотонов на пиксель.

Далее мы более подробно рассмотрели изменение времени жизни флуоресценции Венеры в Lck10-CliF. Чтобы сравнить кривые затухания времени жизни в экспериментальных условиях, мы объединили фотоны из целых изображений (> 200 000 фотонов на кривую) и подогнали данные к тройной экспоненциальной функции затухания (дополнительный рисунок 1). Эта модель была выбрана эмпирически, так как это была наименее сложная модель, которая хорошо подходила для всех экспериментальных условий.Мы зафиксировали значения времени жизни на уровне 3 нс, 1,55 нс и 0,5 нс (или оставили промежуточное время жизни свободным, дополнительная рис. 2) и нанесли доли на уровень экспрессии для каждой клетки (рис. 1d – f).

Время жизни 3 нс в Lck10-CliF, вероятно, представляет собой собственное время жизни Венеры в отсутствие функционального акцептора, поскольку оно было похоже на время жизни Венеры в Lck10-Венера (дополнительный рис. 1a) и опубликованное значение 30 . Нефункциональные акцепторы mCherry в Lck10-CliF могут быть результатом медленной скорости созревания и ограниченной свободы вращения и, следовательно, дипольного выравнивания, в частности, поскольку флуоресцентные белки были связаны с мембраной 31 .Доля времени жизни 3 нс уменьшалась с увеличением уровня экспрессии белка, что свидетельствует о появлении межмолекулярного FRET при более высоких плотностях. Уменьшение доли времени жизни 3 нс сопровождалось увеличением доли времени жизни как 1,55, так и 0,5 нс (рис. 1г). Общее увеличение эффективности FRET может быть вызвано усиленным межмолекулярным FRET за счет кластеризации белков и/или внутримолекулярного FRET за счет лучшего дипольного выравнивания сенсора в кластерах.

У Lck10-Venus самая длинная продолжительность жизни ∼3 нс явно была доминирующей, и ее доля лишь незначительно уменьшалась по мере увеличения уровня экспрессии Lck10-Venus (рис.1д; Дополнительный рис. 2). Напротив, когда Lck10-Venus и mCherry-H-Ras11 были совместно экспрессированы, доля, принадлежащая к самому длинному времени жизни, уменьшалась, а доля промежуточного (1,7 нс) времени жизни увеличивалась с увеличением плотности белка (рис. 1f; дополнительная рис. 1в; дополнительный рис. 2). Доля самого короткого (0,5 нс) времени жизни была постоянной и лишь немного увеличивалась при чрезвычайно высоких уровнях экспрессии. Взятые вместе, мы предполагаем, что промежуточное время жизни в Lck10-CliF может представлять собой межмолекулярный FRET, поскольку оно больше всего увеличивается с плотностью белка.Время жизни 0,5 нс в CliF можно рассматривать как внутримолекулярную FRET Венеры в условиях низкой плотности белка, поскольку эта доля была очень незначительной (<5%) с конструкцией только для донора, даже когда коэкспрессировался mCherry-H-Ras11. Молекулы Lck10-CliF в условиях очень высокой плотности белка могут также проявлять межмолекулярный FRET при очень коротких временах жизни (то есть ~0,5 нс). Это возможно потому, что с увеличением плотности белка увеличивается не только доля молекул, участвующих в межмолекулярной FRET, но и эффективность самой межмолекулярной FRET, поскольку на каждую молекулу донора доступно больше молекул-акцепторов для переноса энергии.Небольшое увеличение промежуточного времени жизни при высокой плотности белка в Lck10-Venus, вероятно, связано с изменением конформации хромофора в условиях скопления белков, как недавно сообщалось 32 . Следует отметить, что изменение амплитуды 1,9 нс в Lck10-Венера существенно отличалось от изменения 1,55 нс в CliF как по интенсивности, так и по скорости в зависимости от плотности белка. Вполне вероятно, что события FRETing в CliF подавляют изменение конформации хромофора в условиях скопления белков.

CliF сообщил об индуцированном светом скоплении белков

Учитывая чувствительность Lck10-CliF к концентрации белка в плазматической мембране, мы были мотивированы проверить возможность CliF обнаруживать образование кластеров мембранных белков. Таким образом, мы слили CliF с мембранным белком, самоассоциацию которого можно искусственно контролировать. Мы использовали светочувствительный домен CY2PHR (аминокислоты 1–498) фоторецептора Cryptochrome, клонированного из Arabidopsis , который проявляет обратимую светозависимую кластеризацию 33 .Как и прежде, мы также включили мембранный якорь 27 для нацеливания белка на плазматическую мембрану. В то время как конструкция, лишенная мембранного якоря, демонстрировала нормальные светоиндуцированные свойства кластеризации (данные не показаны), исходные заякоренные в мембране слитые белки CY2PHR не смогли сформировать кластеры. Таким образом, мы вставили цитоплазматический домен CD3ζ (~100 аминокислот) комплекса TCR-CD3 между мембранным якорем (Lck10) и CliF (рис. 2а), чтобы увеличить расстояние CY2PHR до плазматической мембраны, что полностью восстановило светоиндуцируемые свойства кластеризации CY2PHR.Полученный репортер CY2PHR-CliF не только локализовался на плазматической мембране в клетках COS-7, но также группировался при облучении светом с длиной волны 488 нм (дополнительный фильм 1).

Рисунок 2: FLIM-анализ флуоресценции донора в CY2PHR-CliF.

( a ) Схематическое изображение CY2PHR-CliF, состоящего из мембранного якоря (Lck10), цитозольного хвоста CD3ζ (CD3ζ цито ), CliF и CY2PHR. При облучении светом CY2PHR-CliF образует кластеры, что приводит к усилению межмолекулярного FRET, воспринимаемого CliF.( b ) Интенсивно-взвешенное, псевдоокрашенное FLIM-изображение Венеры (окрашено от синего до красного для короткого или длительного времени жизни, как указано) в клетках COS-7, экспрессирующих CY2PHR-CliF, до и после 30-секундного облучения низкоинтенсивным светом с длиной волны 488 нм до вызвать кластеризацию. Масштабная линейка, 2  мкм. ( c ) Среднее время жизни донора CY2PHR-CliF (черный) и CY2PHR-Venus (красный) в трансфицированных клетках до и после облучения светом 488 нм, то есть в условиях отсутствия кластеров и кластеров. Горизонтальные столбцы обозначают средние значения ( n = 20 ячеек), столбцы погрешностей — с.Эм.; * P <0,01 (непарный t — тест). ( d , e ) Доли времени жизни Венеры в CY2PHR-CliF ( d ) и CY2PHR-Венера ( e ) до и после светоиндуцированной кластеризации. Фракции были получены путем подгонки затухания интенсивности за время жизни Венеры к тройной экспоненциальной функции затухания с указанными значениями времени жизни. Горизонтальные столбцы обозначают средние значения, а столбцы погрешностей — стандартную ошибку. Данные, показанные в d , e , взяты по крайней мере из 15 ячеек, * P <0.01 (непарный т -тест).

Мы выполнили прижизненную визуализацию донора с помощью CY2PHR-CliF до и после облучения светом с длиной волны 488 нм. В качестве контроля мы также исследовали изменения продолжительности жизни донорской конструкции CY2PHR-Venus в тех же условиях. Ожидалось, что светоиндуцированная кластеризация CY2PHR-CliF увеличит безызлучательный перенос энергии и опустошит возбужденное состояние молекул донора, что приведет к сокращению его времени жизни. FLIM-изображение CY2PHR-CliF, экспрессированного в клетках COS-7, показало, что кластеризованная область имеет уменьшенное время жизни, которое было значительно короче, чем время жизни некластеризованных областей на том же изображении или до облучения (рис.2б). Время жизни Венеры в CY2PHR-CliF сократилось в среднем с 2,41 нс до 1,82 нс из-за кластеризации (рис. 2в), что составляет изменение на 32,9%. Когда донорскую конструкцию CY2PHR-Venus исследовали в тех же условиях, мы также обнаружили снижение времени жизни флуоресценции с 2,95 нс до 2,69 нс. Мы приписали это 10% изменение продолжительности жизни недавно сообщенным изменениям в конформации хромофора из-за молекулярной скученности 32 . В наших экспериментах мы исключили возможность изменения продолжительности жизни, вызванного фотообесцвечиванием 34,35 (дополнительный рис.3), но могут быть и другие факторы окружающей среды, которые могут влиять на время жизни флуоресценции. Тем не менее, мы пришли к выводу, что акцептор в CY2PHR-CliF существенно увеличивает чувствительность времени жизни Венеры к соседним молекулам и, следовательно, динамический диапазон сенсора кластера.

Как и в случае с экспериментами, показанными на рис. 1, время жизни Венеры в CY2PHR-CliF также лучше всего соответствовало тройной экспоненциальной функции затухания со временем жизни 3 нс, 1,55 нс и 0,5 нс для некластеризованного CY2PHR-CliF и 3 нс, 1.55 нс и 0,6 нс для сгруппированного CliF (дополнительный рисунок 4а). Когда промежуточное время жизни было оставлено свободным, подгонка вернула промежуточное время жизни 1,74 ± 0,25 нс и 1,56 ± 0,29 нс (среднее значение ± стандартная ошибка) до и после кластеризации соответственно, а доли были сопоставимы с фиксированным и свободным временем жизни (дополнительный рис. 5а,в). Это говорит о том, что изменения времени жизни Венеры, вызванные кластеризацией (рис. 2б, в) и высокой плотностью белка (рис. 1), вероятно, вызваны одними и теми же механизмами. Подгонка конструкции CY2PHR-Венера только для Венеры к трехкомпонентной функции распада привела к значениям времени жизни 3 нс, 1.9 нс и 0,5 нс (дополнительный рис. 4b) и 3 нс и 1,15 ± 0,37 нс до кластеризации, индуцированной светом, и 3 нс и 1,71 ± 0,20 нс после кластеризации при подгонке к двойной экспоненциальной функции затухания (дополнительный рис. 5b, г). Мы сравнили доли, принадлежащие этим временам жизни, как для CY2PHR-CliF (рис. 2d), так и для CY2PHR-Venus (рис. 2e). Как и ожидалось, часть времени жизни 3 нс в CY2PHR-CliF, которую мы выше отнесли к собственному времени жизни Венеры, была уменьшена при светоиндуцированной кластеризации из-за увеличения FRET.Наблюдалось сопутствующее небольшое увеличение доли 1,55 нс и существенное увеличение доли 0,6 нс. Одно из возможных объяснений состоит в том, что время жизни 1,55 нс представляет собой молекулы CY2PHR-CliF, расположенные в небольших кластерах с ограниченной способностью к межмолекулярному FRET, в то время как время жизни 0,6 нс отражает молекулы CY2PHR-CliF, расположенные в более крупных и плотных кластерах, где донорные молекулы могут передавать значительное количество энергии соседним молекулам-акцепторам. В этом сценарии доля 0.Время жизни 6 нс будет включать как молекулы, которые подвергаются внутримолекулярному FRET, так и молекулы, которые подвергаются межмолекулярному FRET в очень плотных белковых кластерах. Это связано с тем, что когда возбужденная молекула донора окружена несколькими акцепторами в непосредственной близости, вероятность того, что молекула донора передаст свою энергию соседним молекулам акцептора, линейно увеличивается с количеством акцепторов 21,22 , что приведет к дополнительному укорочению срока службы и может объяснить незначительное изменение между 1.Время жизни от 55 нс до 0,6 нс. Однако следует отметить, что другие факторы окружающей среды также могут влиять на время жизни флуоресценции флуоресцентных белков. В CY2PHR-Venus доля времени жизни 3 нс также уменьшалась при кластеризации с одновременным увеличением доли времени жизни 1,9 нс, что, вероятно, связано с вызванным скоплением белков изменением хромофора, которое недавно было описано 32 . Это говорит о том, что сама Венера чувствительна к кластеризации белков. В заключение, хотя точный механизм того, как кластеризация белков влияет на время жизни Венеры, до конца не изучен, это не исключает использования CliF в качестве качественного сенсора кластеров.

Затем мы проверили эффективность CliF для мониторинга кластеризации CY2PHR в живых клетках с использованием простого логометрического подхода к визуализации, не требующего подгонки. Здесь мы использовали лазер с длиной волны 514 нм как для светоиндуцированной кластеризации, так и для возбуждения Венеры. Мы записали отношение интенсивностей донорной (525–555 нм) и акцепторной (610–700 нм) флуоресценции (соотношение R/G) как меру эффективности FRET с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа при частоте кадров 1 Гц. При облучении светом с длиной волны 514 нм на поверхности клеток начали появляться оптически разрешенные кластеры (рис.3а). Формирование и рост кластеров можно было наблюдать на профилях линий, снятых в разные моменты времени (рис. 3б), где возникающие кластеры имели высокую эффективность FRET (отношение R/G). Хотя положение кластеров со временем немного сместилось, указывая на то, что кластеры были мобильными, можно было наблюдать увеличение эффективности FRET отдельных кластеров по мере увеличения размеров кластеров. При наблюдении за всем изображением эффективность FRET достигла плато примерно через 40 с после светоиндуцированной кластеризации (рис.3б, вставка). По сравнению с некластеризованным отношением R/G в момент времени 0 с эффективность FRET увеличилась на 63%. Этот результат ясно продемонстрировал способность CliF обнаруживать кластеризацию мембранных белков с помощью логометрической визуализации с высоким пространственным и временным разрешением.

Рисунок 3: Обнаружение светоиндуцированной кластеризации CY2PHR с помощью CliF с корреляционной спектроскопией изображений (ICS) и отслеживанием частиц.

( a ) Донорно-акцепторные (R/G) логометрические изображения светоиндуцированной кластеризации CY2PHR-CliF в трансфицированных клетках COS-7 в указанные моменты времени.Изображения псевдоокрашены от фиолетового до синего, что соответствует низкой и высокой эффективности FRET. Масштабная линейка, 2  мкм. ( b ) Значения R/G вдоль линейного сканирования в положениях, показанных в a в выбранные моменты времени. Вставка: соотношение R/G отдельных кадров в зависимости от времени. ( c ) Анализ корреляционной спектроскопии изображений (ICS) данных, показанных в a . Диаграмма рассеяния соотношения R/G в зависимости от степени агрегации для каждого кадра. Амплитуда ICS была нормализована к общей интенсивности (интенсивность донора + акцептора, R + G) для каждого кадра, что дало значение степени агрегации (ось x ).Он показал линейную зависимость (наклон = 2,52, R 2 = 0,75) с эффективностью FRET CY2PHR-CliF (соотношение R/G, ось y ). ( d ) Кластерное отслеживание данных, показанное в a для каждого кластера, значение R/G (отражающее плотность кластера) было построено в зависимости от значения R+G (отражающего количество молекул), что привело к линейной зависимости (наклон =0,008, при R 2 =0,72). Символы окрашены в цвета c , d в соответствии с номером кадра во времени.Данные в b d являются единичными репрезентативными данными 5 ячеек.

Затем мы оценили, можно ли мультиплексировать CliF с такими анализами, как спектроскопия корреляции изображений (ICS) и отслеживание отдельных частиц (SPT) для количественной оценки пространственно-временной организации меченого белка. В ICS амплитуда функции пространственной корреляции обратно пропорциональна количеству признаков, которые вызывают флуктуации интенсивности в изображении 13 . По мере того, как молекулы становились более сгруппированными, количество флуктуирующих признаков уменьшалось, тогда как общая интенсивность изображения оставалась постоянной независимо от состояния кластеризации молекул (дополнительный рис.6). Следовательно, отношение амплитуды корреляционной функции ICS к интенсивности изображения отражало среднюю плотность кластеров, называемую степенью агрегации. Как и ожидалось, степень агрегации CY2PHR-CliF со временем увеличивалась (рис. 3с). Когда степень агрегации каждого кадра была нанесена на график в зависимости от эффективности FRET на этих изображениях (соотношение R/G), мы обнаружили положительную линейную корреляцию, предполагающую, что метод общей эффективности CliF FRET достоверно сообщает о кластеризации белков.

Мы также использовали алгоритм отслеживания отдельных частиц, чтобы нанести на карту центр отдельных кластеров. Это было сделано путем подгонки суммы профилей интенсивности донора и акцептора (R+G) каждого кластера к функции Гаусса, таким образом извлекая амплитуды R/G и R+G для каждого кластера. Поскольку кластеризация белка CY2PHR-CliF увеличивалась со временем, ожидалось, что значение R/G, отражающее плотность кластера, будет увеличиваться со временем. Точно так же значение R + G отдельных кластеров, которое можно приравнять к количеству молекул на кластер, также увеличивалось с течением времени, поскольку кластеры CY2PHR-CliF образовывались путем агрегации мономеров.Мы обнаружили ожидаемую положительную линейную зависимость между значениями R/G и R+G для отдельных кластеров (рис. 3d). В совокупности эксперименты с CY2PHR-CliF демонстрируют, что CliF сообщает о кластеризации белков и может сочетаться с установленными подходами для пространственно-временного анализа молекулярной динамики.

Обнаружение кластеров рецепторов Т-клеток с помощью CliF

Мы использовали разработанный CliF для динамического измерения плотности кластеров TCR. Действительно, плотность упаковки комплексов TCR-CD3 в настоящее время неизвестна.Это важно, потому что плотность кластеров TCR может отражать их состояние передачи сигналов. В покоящихся клетках цитоплазматические домены CD3ζ и CD3ɛ связаны с внутренним листком плазматической мембраны посредством электростатических взаимодействий, что делает их недоступными для киназы Lck и, таким образом, для фосфорилирования 36,37 . При высокой плотности TCR-CD3 цитоплазматические хвосты CD3ζ и CD3ɛ могут отсоединиться, позволяя начать передачу сигналов TCR. Таким образом, кластеризация TCR-CD3 может сделать рецептор компетентным в отношении сигнала.

Во-первых, мы хотели проверить, можно ли использовать CliF для обнаружения кластеров TCR. Для этого мы слили CliF с С-концом полноразмерного CD3ζ и использовали донорскую конструкцию, CD3ζ-Venus, в качестве контроля. Эндогенный и сверхэкспрессированный полноразмерный CD3ζ образует гомодимеры и конститутивно связан с комплексом TCR-CD3 38 . Мы стимулировали клетки Jurkat, экспрессирующие либо CD3ζ-CliF, либо CD3ζ-Venus, на покровных стеклах, покрытых анти-CD90 (неактивирующими) или анти-CD3 и анти-CD28-антителами (анти-CD3+CD28-Ab, активирующие), чтобы сравнить покоящиеся и активированные Т-клетки.Мы подтвердили, что анти-CD90-поверхности не вызывают внутриклеточных потоков кальция и экспрессии CD69 по сравнению с клетками на нефункционализированных покровных стеклах, покрытых поли-L-лизином (PLL), и клетками в суспензии (дополнительная рис. 7). Визуальный осмотр изображения времени жизни донора позволяет предположить, что CD3ζ-CliF и CD3ζ-Venus образовывали кластеры в покоящихся клетках и что сгруппированный CD3ζ-CliF демонстрировал более короткое время жизни по сравнению с некластеризованным CD3ζ-CliF (рис. 4a, b). Среднее время жизни донора составило 2,01±0.05 нс и 1,86 ± 0,04 нс (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) для CD3ζ-CliF и 2,91 ± 0,01 нс и 2,85 ± 0,02 нс для CD3ζ-Venus в покоящихся и активированных Т-клетках соответственно. Таким образом, большее изменение времени жизни наблюдалось для CD3ζ-CliF, чем для CD3ζ-Venus при активации Т-клеток, что приводило к диапазону значений FRET для CD3ζ-CliF в активированных Т-клетках (рис. 4а). Неоднородность эффективности FRET с CD3ζ-CliF в кластерах на том же изображении указывает на то, что кластеры имеют переменную молекулярную плотность, что согласуется с данными микроскопии локализации одиночных молекул 4 .

Рисунок 4: FLIM-изображение кластеризации CD3ζ-CliF в Т-клетках.

( a , b ) Прижизненное изображение донорских клеток Jurkat, экспрессирующих CD3ζ-CliF ( a ) или CD3ζ-Venus ( b ) в состоянии покоя (поверхность стекла покрыта анти-CD90 антителами) и при активации ( поверхность стекла, покрытая смесью анти-CD3 и анти-CD28 антител). Время жизни псевдоокрашено от синего до красного, как показано на цветовой шкале. Масштабная линейка, 2  мкм. ( c ) Фракции продолжительности жизни, полученные из тройного экспоненциального распада, подходят для покоящихся и активированных Т-клеток.Горизонтальные столбцы обозначают средние значения, а столбцы погрешностей — стандартную ошибку. Данные взяты из n = 13 клеток на условие. ( d , e ) Сравнение среднего времени жизни донора областей высокой интенсивности (голубой, в зависимости от интенсивности пикселей) и областей низкой интенсивности (пурпурный) ( d ) активированной клетки, показанной на a и соответствующие значения ( e ). В e каждый символ представляет собой одну ячейку, P <0,01, n = 9 ячеек (спаренные t -тест).Для всех данных FLIM было записано более 200 фотонов на пиксель.

Чтобы получить более подробную информацию о том, как время жизни Венеры различалось в покоящихся и активированных Т-клетках, мы снова подобрали затухание времени жизни Венеры к тройной экспоненциальной функции затухания со значениями времени жизни 3 нс, 1,55 нс и 0,5 нс. Доли времени жизни предполагают, что большинство молекул CD3ζ-CliF находилось в кластерах, которые подверглись межмолекулярному FRET со временем жизни 1,55 нс (рис. 4c). Альтернативная процедура подгонки, в которой промежуточное время жизни в функции тройного экспоненциального распада было оставлено свободным, дала аналогичные результаты (дополнительный рис.8). Следуя интерпретации доли времени жизни CY2PHR-CliF (рис. 2d), молекулы CD3ζ-CliF, подвергающиеся межмолекулярному FRET, могут иметь время жизни 1,55 нс и 0,5 нс. Статистически значимых изменений при активации Т-клеток в доле времени жизни 1,55 нс не наблюдалось. Одно из возможных объяснений заключается в том, что фракция и плотность менее плотных и меньших кластеров CD3ζ-CliF не ремоделировались после активации (рис. 4с). Напротив, значительное увеличение доли, соответствующей 0.Наблюдалось время жизни 5 нс, что позволяет предположить, что молекулы CD3ζ-CliF образовывали более крупные и компактные кластеры при активации Т-клеток. Однако, поскольку происхождение доли 0,5 нс до конца не изучено, возможно и другое объяснение того, как кластеризация CD3ζ-CliF влияет на наблюдаемые изменения времени жизни.

Затем мы установили порог изображения FLIM на основе интенсивности отдельных пикселей, чтобы отличить несгруппированные (пурпурные) области от сгруппированных (голубые, рис. 4d). Мы использовали среднее время прихода фотонов как меру среднего времени жизни.Это показало, что сгруппированная область действительно имела более короткое время жизни, чем некластеризованная область во всех клетках (рис. 4e). Таким образом, мы продемонстрировали, что присоединения CliF к CD3ζ комплекса TCR было достаточно для обнаружения кластеров TCR. Результат предполагает ремоделирование плотности кластера TCR при активации Т-клеток.

Чтобы извлечь количественную информацию из этих данных, например, максимальное количество акцепторов, которым молекула CD3ζ-CliF может передать свою энергию, и радиус Ферстера при максимальной эффективности FRET (см. Дополнительное примечание, дополнительные рисунки 9 и 10), требует допущений что (i) изменения продолжительности жизни вызваны FRET, а не другими факторами окружающей среды, (ii) внутримолекулярный FRET не меняется при кластеризации и (iii) что скорость межмолекулярного переноса зависит только от количества других молекул CliF внутри кластера.Как обсуждалось выше, сложно однозначно и исключительно приписать изменения времени жизни донорской флуоресценции физическим процессам, таким как межмолекулярный и внутримолекулярный FRET. Количественный анализ данных FRET с флуоресцентными белками особенно сложен, учитывая, что многие флуоресцентные белки не имеют моноэкспоненциального затухания и что даже случайно ориентированные флуоресцентные белки, подвергающиеся FRET, могут демонстрировать различную эффективность FRET, хотя присутствует только один процесс FRET 39 .Преимущество CliF и причина его разработки заключаются в его способности качественно регистрировать пространственно-временные изменения кластеризации мембранных белков с высокой чувствительностью. Таким образом, затем мы исследовали кластеризацию CD3ζ в живых Т-клетках.

Кластеризация и движение TCR в иммунной синпазе

Сигнальные микрокластеры TCR преимущественно формируются во внешней области иммунологического синапса 5,6,7 и задействованные TCR предпочтительно транспортируются в центр иммунологического синапса 40 .Это активное, опосредованное актином движение, как полагают, регулирует передачу сигналов TCR 6,41 . Следовательно, мы использовали возможности CliF для визуализации живых клеток, чтобы определить, как модулируется плотность кластеров TCR во время их центростремительного транспорта от периферии к центральной области иммунологического синапса, называемой периферическим и центральным надмолекулярным синапсом. кластер активации (cSMAC и pSMAC соответственно). Мы использовали поддерживаемые липидные бислои, которые содержали белок адгезии ICAM-1 и молекулы пептид-презентирующего главного комплекса гистосовместимости класса I (pMHC-I) для стимуляции клеток Jurkat, экспрессирующих родственный TCR OT-I.Когда Т-клетки запускаются молекулами pMHC на латерально подвижных бислоях, кластеры TCR формируются на периферии и транспортируются к cSMAC актин-зависимым образом -25-. Здесь мы отслеживали движение и плотность кластеров с помощью CD3ζ-CliF и обнаружили, что кластеры CD3ζ-CliF имеют более высокую скорость как диффузии, так и суммарного потока в Т-клетках на бислоях по сравнению с кластерами CD3ζ-CliF в Т-клетках на антителе (анти-CD3+анти-антител). -CD28 Ab)-покрытые покровные стекла (дополнительная рис. 11). Наблюдаемые значения диффузии TCR были аналогичны предыдущим отчетам 7,42 .

Двухканальная покадровая визуализация в режиме TIRFM показала, что клетки начали распространяться по бислою примерно через 1 мин после приземления. Кластеры TCR непрерывно формировались на краю клетки и постепенно переносились в центр клетки, как описано ранее 5,6,7 . Мы использовали алгоритмы отслеживания отдельных молекул 43 для отслеживания отдельных кластеров с течением времени (рис. 5а, б). Как и выше, мы отслеживали значения R/G и R+G для каждой точки траектории. Хотя оба значения пропорциональны количеству молекул, содержащихся в кластерах, на логометрическое измерение в меньшей степени влияют шум, потеря фокуса и локальные изменения концентрации белка из-за взъерошивания мембраны.Даже в отдельных траекториях графики R+G часто демонстрировали больше вариаций по длине траектории, чем графики R/G (рис. 5b).

Рисунок 5: Отслеживание движения и плотности кластера TCR во время активации Т-клеток.

( a ) Анализ слежения для определения направленности кластеров CD3ζ-CliF: Δ r начало-конец измеряет движение кластера к центру клетки или от него. Траектория имеет цветовую кодировку от синего до красного, чтобы указать положение во времени.( b ) Репрезентативная траектория кластера CD3ζ-CliF (белый пунктирный квадрат на изображении клетки) на некотором расстоянии от центра клетки (желтый круг на изображении клетки) и результирующие кривые R/G и R+G для этой траектории. Наклоны траекторий R/G и R+G были извлечены (черная линия) с помощью линейной регрессии. Масштабная линейка, 2  мкм и 0,5  мкм на увеличенных изображениях b . ( c , d ) Диаграмма рассеяния наклонов R/G в зависимости от значений Δ r начало-конец для ~400 траекторий TCR для клеток, активированных на pMHC-презентирующих липидных бислоях ( c ) и антителе Поверхности, покрытые (анти-CD3+анти-CD28 Ab) ( d ).Графики рассеяния были разделены на четыре квадранта, соответствующие увеличению/уменьшению плотности кластеров и перемещению к/от центра клетки (c.c.). Указано количество траекторий в каждом квадранте. Данные, показанные в c , d , представляют собой анализ одной клетки. В каждом из условий анализировали по 5 клеток.

Чтобы отобразить изменение плотности кластеров по мере перемещения кластеров к центру клетки, было определено изменение расстояния кластера относительно центра клетки, Δ r начало-конец , как показано на рис.5а. Наклон R/G каждой траектории был построен в зависимости от значения Δ r начала-конца таким образом, чтобы каждая траектория попала в один из четырех квадрантов: движение к центру ячейки или удаление от него и увеличение или уменьшение плотности кластера (рис. 5в,г). Для Т-клеток, стимулированных мобильными молекулами pMHC, наблюдалось увеличение плотности кластеров по мере того, как кластеры TCR перемещались к cSMAC в центре клетки, и наблюдалась потеря плотности кластеров по мере удаления TCR от центра клетки (рис.5в). Для Т-клеток, стимулированных адгезивными иммобилизованными антителами, такой тенденции не обнаружено (рис. 5г). Скорее наблюдалась чистая потеря плотности кластеров CD3ζ в клетках, стимулированных антителами. На 284 из 421 траекторий наблюдалось уменьшение плотности скоплений. Это указывает на то, что перенос кластеров TCR-CD3ζ через иммунологический синапс по направлению к cSMAC связан с ремоделированием в более плотные агрегаты. Эти эксперименты еще раз подчеркивают силу CliF в качестве сенсора кластеризации, позволяющего сообщать о динамических свойствах белковых кластеров в условиях живых клеток.

Руководство по размерам проводов и материалам и др.

Comparte este artículo en

Гитарные лады являются важной частью инструмента, влияющей на удобство и тембр. Мы анализируем все, что касается размеров ладовой проволоки и материалов.

Лады и гитара

Как вы, возможно, уже знаете, лады делят гриф на легко различимые полутоновые интервалы, которые говорят нам, где находятся ноты. В отличие от других струнных инструментов, таких как скрипка, виолончель, контрабас и других, гитара имеет лады, облегчающие ее исполнение.

Некоторые гитаристы экспериментировали с безладовыми гитарами, например с бас-гитарами, но без особого успеха. Одна из основных причин, по которой гитара раздражает, заключается в том, что аккорды составляют неотъемлемую часть игры на гитаре. Без ладов играть 6-нотные аккорды было бы очень сложно.

Конечно, использование ладов имеет свои ограничения, так как не позволяет использовать микротоны или экзотические восточные гаммы, если только вы не используете Slide , который представляет собой не что иное, как подвижный лад, управляемый одним из наших пальцев.К счастью, не многие гитаристы хотят использовать микротоны или восточные гаммы.

Вам также может быть интересно узнать больше о частях электрогитары и важности каждой .

Гитарные Т-образные лады

История ладов

Материал ладов: кость к металлу

В первых струнных инструментах и ​​предшественниках гитары с ладами использовались струны из кишки, поэтому лады обычно делались из кости , как и порожек .Кость достаточно прочна для струн из кишки, но с появлением намотанных металлических струн металл стал предпочтительным материалом для мастеров для изготовления ладов. Таким образом, сегодня большинство ладов изготовлено примерно из 18% никеля для долговечности и 80% из меди для гибкости.

Форма лада: планка типа «T»

Первые металлические лады сильно отличались от тех, которые мы знаем и используем сегодня. Эти первые типы ладов широко известны как лады bar . Упомянутое название связано с тем, что они представляют собой металлические стержни с плоскими сторонами, то есть прямоугольные, которые расходятся вверх и помещаются в более широкие прорези ладов, чем те, которые используются в настоящее время.

Лад для акустической гитары

Лад для акустической гитары по-прежнему доступен для реставрационных работ на старых или «винтажных» классических или акустических гитарах. Есть даже акустические гитаристы, которые предпочитают ощущение и внешний вид барных ладов для своих акустических и испанских гитар.

Нынешний лад T был запатентован в 1920-х годах Клинтоном Ф. Смитом . Этот лад вскоре стал отраслевым стандартом и остается им по сей день. Буква « T » означает « Tang ».

Если смотреть сбоку, Т-образный лад очень похож на гриб. Лад в виде елочки намного уже, чем лад с перекладиной, и был разработан, чтобы входить в более узкие прорези на грифе. Лады удерживаются на месте за счет фрикционной посадки, чему способствуют выступы, которые помогают захватывать боковые стороны и предотвращают выскальзывание лада из паза.

Т-образный лад слева и планка справа

Размеры и размеры гитарных ладов

Хотя большинство ладов для электрических, испанских/классических и акустических гитар в настоящее время относятся к ладам T-типа , они бывают разных размеров.Коронки различаются по ширине и высоте, что влияет на ощущение гитары и удобство игры. Некоторым гитаристам может даже казаться, что они могут влиять на тон гитары.

Современные лады: высокие и широкие

Высокие заводные головки могут создать ощущение, что накладка грифа слегка украшена фестонами, и облегчают проникновение пальцев под струны. Это позволяет вам делать бенды и делать вибрато более простым и контролируемым способом. С другой стороны, недостатки заключаются в том, что при скольжении по грифу можно более заметно и беспокойно ощущать лады под пальцами, а слишком сильно надавливая на струну, можно повлиять на натяжение, а с ним и на строй струны. строка.Для последнего обычно предпочтительнее, чтобы высокие лады также были шире, чтобы можно было сделать коронки с более плавным изгибом и смягчить их на ощупь.

Этот тип ладов предпочитают Rock и Shredder Lead гитаристы. Самый представительный и самый большой размер ладов называется Jumbo .

Традиционные или винтажные лады: низкие и узкие

Хотя в Fender традиционно используются более тонкие лады, чем в Gibson , оба размера тоньше и ниже, чем современные лады Jumbo .Эти лады более гладкие в руке.

В течение 1950-х многие джазовые музыканты предпочитали ультранизкие лады. Модель Les Paul Custom в те годы рекламировалась как «Безладовое чудо». Это имеет большой смысл, так как в то время не играли с изгибами.

Размеры лада

Обычно указываются размеры короны, но иногда также необходимо учитывать размеры хвостовика. При переладке также рекомендуется измерить глубину и ширину хвостовика, чтобы определить, будет ли новая ладовая проволока, которую вы хотите использовать, совместима с существующими прорезями для ладов.Хотя это часть работы мастера, и гитарист обычно игнорирует ее, важно помнить об этом, когда имеешь дело с дорогими или винтажными гитарами.

При покупке гитары важно обратить внимание на то, какие у нее лады. Так как работа по переладке гитары стоит несколько дорого. Вы часто встретите названия размеров ладов гитары: « большие лады » или « средние большие лады », « узкие и высокие » и другие.Поэтому ниже вы можете подробно ознакомиться с основными размерами, используемыми как Fender , так и Gibson .

Самые популярные размеры гитарных ладов

Основным производителем ладов является Dunlop Manufacturing Inc. , основные размеры вы подробно увидите ниже. Они идентифицируются по номеру детали, названию, где это применимо, ширине и высоте короны, они от меньшего к большему:

  • 6230 : также известный как « Vintage Fret» размера , это самый маленький лад, который можно найти на старых грифах Fender (1.98 x 1,09 мм / 0,078 x 0,043 дюйма).
  • 6150 : « Vintage Jumbo » шире, но не так высоки, как 6230 или Vintage (2,59 x 1,07 мм / 0,102″ x 0,042″).
  • 6105 : также известный как «Современный узкий и высокий», в настоящее время очень популярный (2,28 x 1,40 мм / 0,090″ x 0,055″). Это основной калибр, используемый Gibson , а также активно используемый Fender .
  • 6130 : популярные « Medium Jumbo », они выше, но довольно узкие (2.69 x 0,91 мм / 0,106 x 0,036 дюйма).
  • 6100 : « Jumbo » или « Modern Jumbo » — это самый большой доступный лад (2,79 x 1,40 мм / 0,110″ x 0,055″).

Переточка в качестве ремонта или усовершенствования

Размер зависит исключительно от предпочтений и удобства. Размеры ладов могут повлиять на ваш стиль игры. Те, кто привык играть на грифе, обычно предпочитают низкие и средние высокие лады, 6130 , 6150 или 6230 идеальные варианты.С другой стороны, большой лад 6100  может обеспечить комфорт при игре и, как правило, обеспечивает лучший сустейн  и облегчает изгибы .

Как мы видели, многие ранние гитары поставлялись с низкими ладами, так как в первые годы существования гитары изгиб не использовался. Однако игра на гитаре эволюционировала, и винтажные гитары со сверхнизкими ладами могут затруднить игру. По этой причине, если гитары не являются оригинальными винтажными инструментами, хорошо видно, что их можно «обновить», установив на них более высокую и широкую ладовую проволоку.

Вас также могут заинтересовать лучших советов по модернизации электрогитары .

Лады и тембр гитары

Существует множество мифов, связанных с размером лада и его влиянием на тембр. Но реальность такова, что изменение материала минимально, а хорошо укороченный и туго натянутый лад имеет аналогичную контактную поверхность со струной. Так что утверждение, что более толстые лады могут увеличить массу и жесткость грифа, является относительным. Сказав это с теоретической точки зрения, мы консультировались с гитаристами, которые обычно рефретируют — меняют лады — свои гитары с большими ладами, такими как Jumbo , в то время как некоторые уверяют, что лады придают гитаре больше атаки , другие также считают, что это также дает больше сустейна .

Очевидно, что это влияет на материал лада. Таким образом, более твердые лады, такие как сталь, обеспечивают большую яркость звука гитары.

С другой стороны, как мы уже говорили, размер и форма лада влияет на то, как вы играете на гитаре, следовательно, это может повлиять на ваш звук, потому что это влияет на ваш личный стиль. Более высокая ладовая проволока помогает играть быстрее, в то время как вам нужно быть более точным в том, насколько сильно вы нажимаете на струны, чтобы не расстроить ноты.

Материалы для гитарных ладов

Никель, серебристые гитарные лады

Как мы уже видели, подавляющее большинство ладов электрогитар изготовлено из нейзильбера, также известного как нейзильбер. Как ни странно, в «немецком серебре» на самом деле нет серебра. Нейзильбер представляет собой тройной сплав, состоящий из цинка, меди и никеля.

Пропорции варьируются, но большинство ладов содержат около 18% никеля для долговечности и 80% меди, чтобы сделать их достаточно гибкими и мягкими, чтобы их можно было полировать, формировать и полировать для использования.Например, лады Jescar NS18 состоят только из 62% меди, 18% никеля и 20% цинка.

гитарные лады

Стальные гитарные лады

Некоторым людям не повезло иметь аллергию на никель, поэтому лады из нержавеющей стали являются для них вариантом. Нержавеющая сталь чрезвычайно требовательна к инструментам и требует больших физических усилий для выравнивания, придания формы и полировки. Это делает их более сложными в работе и, следовательно, более дорогими в установке в дополнение к их стоимости.

Положительным моментом является то, что лады из нержавеющей стали обеспечивают сверхгладкую поверхность, на которую натягиваются струны и сохраняют свой блеск на неопределенный срок.Сталь также настолько прочна, что вам, возможно, больше никогда не понадобится переналадка, хотя это влияет на долговечность струн, особенно для тех, кто использует струны из чистого никеля, потому что он мягче стали.

Лады из нержавеющей стали, гораздо более твердые, добавляют яркость звучанию вашей гитары, таким образом, есть люди, которым нравится эффект «более акустического» звучания, а есть люди, которые, наоборот, их избегают. по той же причине.

Гитарные антиаллергенные лады Jescar

Jescar ‘s EVO Ni-Free Gold лад – еще один вариант, не содержащий никеля.Они изготовлены из сплава, специально разработанного для людей с аллергией на никель. Говорят, что она прочнее никеля и очень долговечна, но мягче и с ней легче работать, чем ладовая проволока из нержавеющей стали.

Вывод на лады электрогитары

Так что, как и многое другое, лады — дело вкуса. Но когда вы найдете правильный размер и сочетание материалов для вас, это может значительно улучшить ваши впечатления от игры на гитаре, вашей игры и вашего тона.

Ваш идеальный тип лада?


Вы можете поделиться своим мнением в разделе комментариев ниже.


Comparte este artículo en

Сравнение производительности mScarlet-I, mRuby3 и mCherry в качестве акцепторов FRET для mNeonGreen

Abstract

Резонансная передача энергии Фёрстера (FRET) стала чрезвычайно мощным инструментом для профилирования внутри- и межмолекулярных взаимодействий. Благодаря слиянию генетически кодируемых флуоресцентных белков (FP) исследователи смогли обнаружить олигомеризацию белков, активацию рецепторов и транслокацию белков среди других биофизических явлений.Недавно были разработаны два ярких мономерных красных флуоресцентных белка, mRuby3 и mScarlet-I. Эти белки обладают значительно улучшенными физическими свойствами по сравнению с предыдущими поколениями мономерных красных FP, что должно способствовать более широкому внедрению Green/Red FRET. Здесь мы оцениваем способность этих двух белков, наряду с mCherry, действовать как FRET-акцептор для яркого, мономерного, зелено-желтого FP mNeonGreen, используя интенсивометрический FRET и 2-фотонную флуоресцентную визуализацию жизни (FLIM) FRET методы.Сначала мы определили, что mNeonGreen является стабильным донором для двухфотонных экспериментов FLIM при различных условиях визуализации. Затем мы проверили способность красных FP действовать как акцепторы FRET, используя тандемную конструкцию mNeonGreen-Red FP. С этими конструкциями мы обнаружили, что mScarlet-I и mCherry способны эффективно проводить FRET с mNeonGreen в спектроскопическом и FLIM FRET. Напротив, mNeonGreen и mRuby3 FRET имеют гораздо более низкую эффективность, чем предполагалось в этих же анализах. Мы изучаем возможные объяснения этой плохой производительности и определяем, что свойства созревания белка mRuby3 вносят основной вклад.В целом, мы обнаружили, что mNeonGreen является отличным донором FRET, а mCherry и mScarlet-I, но не mRuby3, действуют как практические акцепторы FRET, при этом более яркий mScarlet-I превосходит mCherry в интенсивометрических исследованиях, но mCherry превосходит mScarlet-I. в случаях, когда постоянная эффективность в популяции имеет решающее значение.

Образец цитирования: McCullock TW, MacLean DM, Kammermeier PJ (2020) Сравнение производительности mScarlet-I, mRuby3 и mCherry в качестве акцепторов FRET для mNeonGreen.ПЛОС ОДИН 15(2): e0219886. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886

Редактор: Вадим Э. Дегтярь, Калифорнийский университет в Беркли, США

Поступила в редакцию: 3 июля 2019 г.; Принято: 23 января 2020 г .; Опубликовано: 5 февраля 2020 г.

Авторские права: © 2020 McCullock et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные содержатся в рукописи и файлах со вспомогательной информацией.

Финансирование: Этот проект был поддержан Национальным институтом здравоохранения (https://www.nih.gov/), финансирующим R00NS094761, и Фондом исследований мозга и поведения NARSAD Young Investigator Award (https://www.bbrfoundation.org/). гранты-призы/нарсад-молодому-исследователю-гранты) в DMM и Университет Рочестера (https://www.rochester.edu/) временное финансирование П.Дж.К.. Т.В.М. была частично поддержана Фондом Джона Р. Мурлина Рочестерского университета. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Генетически кодируемые флуоресцентные белки (FP) значительно продвинули фундаментальную и трансляционную биологию. Начиная с клонирования Aequorea victoria green FP[1], начались масштабные и постоянные усилия по расширению количества доступных FP с различными физическими и спектральными свойствами.В настоящее время существует огромное разнообразие ФП во всех частях видимого спектра и даже в некоторых частях ультрафиолетового и инфракрасного спектров. Эти новые белки были либо клонированы из других организмов [2-4], либо разработаны путем эволюции уже идентифицированных FP [4-11]. Этот постоянно расширяющийся каталог FP был рассмотрен другими [12–14], и были созданы новые усилия и архивы для организации этой информации, такие как база данных FPbase [15].

По мере того, как расширялся каталог FP, расширялись и возможности его использования.Особо следует отметить использование FP в качестве биосенсоров, которые могут измерять сигнальные события, клеточные метаболиты, pH, напряжение и многое другое [16]. Многие из этих биосенсоров используют резонансную передачу энергии Ферстера (FRET) как часть своего механизма отчетности, вызывая изменение излучения акцептора при возбуждении донора, когда изменяется интересующая величина. FRET также зависит от ориентации и расстояния [17], а это означает, что величина переноса энергии (описываемая как эффективность FRET) может использоваться для изучения либо стационарного состояния, либо динамических изменений во взаимодействиях белков.Большая часть работы с использованием FP для FRET была выполнена с использованием пар голубых/желтых FP из-за их яркости, но эти белки страдают от большого перекрытия в своих спектрах излучения, что делает интерпретацию результатов излишне сложной, среди других усложняющих факторов. Пары зеленый/красный FP предлагают большее разделение их спектров излучения, сохраняя при этом высокую степень спектрального перекрытия между излучением донора и поглощением акцептора, что обеспечивает эффективную передачу энергии. Зеленые/красные FP также имеют больший радиус Фёрстера, чем большинство пар голубых/желтых белков, что позволяет использовать FRET на больших расстояниях.Возможность обнаруживать FRET на больших расстояниях часто приводит к большему динамическому диапазону и чувствительности. Кроме того, клеточная токсичность синего света была хорошо задокументирована в различных системах [18–22], что подчеркивает необходимость улучшения пар FRET с зеленым и красным смещением. Исторически зеленый/красный FRET был ограничен неблагоприятными флуоресцентными свойствами красного белка [23–26], но сообщается, что несколько недавно разработанных мономерных красных флуоресцентных белков обладают улучшенным поглощением, яркостью и стабильностью, что указывает на то, что они могут действовать как высококачественный FRET. акцепторы для зеленых ФП.

Целью данного исследования является характеристика этих недавно выпущенных красных FP в качестве акцепторов FRET в надежде помочь более широкому внедрению Green/Red FRET. Здесь мы исследуем способность красных FP следующего поколения, mRuby3 и mScarlet-I, а также mCherry действовать как акцептор FRET для зелено-желтого донора FP mNeonGreen. mRuby3[10] — новейшая версия серии красных FP Ruby[8, 9], первоначально разработанных на основе eqFP611[3]. Серия mScarlet красных FP[11] была разработана на основе синтетического генного шаблона, основанного на нескольких встречающихся в природе красных FP.На основе этой стратегии были получены три мономерных красных FP: яркий вариант mScarlet, быстросозревающий вариант mScarlet-I и быстросозревающий вариант mScarlet-H. Для этого исследования мы используем mScarlet-I из-за его быстрого времени созревания, поскольку более медленное созревание менее идеально для исследований слитых белков. mCherry[6], обычно используемый мономерный красный FP, полученный из DsRed[2], включен в это исследование в качестве стандарта. В качестве донорной молекулы мы выбрали mNeonGreen[4], невероятно яркий и стабильный зелено-желтый FP, полученный в результате мономеризации тетрамерного желтого флуоресцентного белка LanYFP[4].

Материалы и методы

Культура клеток и трансфекция

клетки HEK293A (ATCC; Манассас, Вирджиния) поддерживали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 1X GlutaMAX TM , 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (ThermoFisher Scientific; Waltham, MA) и 10 % инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сыворотки (Atlas Biologicals; Fort Collins, CO). Чтобы индуцировать экспрессию флуоресцентных белков, клетки временно трансфицировали с использованием полиэтилениминовой (PEI) трансфекции.Для всех трансфекций указанные количества ДНК и PEI смешивали вместе в среде DMEM, не содержащей добавок, в течение 30 минут перед добавлением к клеткам в указанный момент времени. Для экспериментов FLIM клетки высевали на покровные стекла номер 1 (Warner Instruments; Hamden, CT) в 12-луночные планшеты (Nest Scientific USA; Rahway, NJ) за 48 часов до экспериментов. Затем клетки трансфицировали за 24 часа до начала экспериментов, используя 0,6 мкг кДНК для указанной конструкции и 1,6 мкг ПЭИ в 1 мл среды.Для конфокальных экспериментов клетки высевали в пластиковые чашки для культивирования диаметром 35 мм (Corning; Corning, NY) за 48–72 часа до экспериментов с последующей трансфекцией 1 мкг кДНК с использованием 2,4 мкг PEI в 2 мл среды за 24–36 часов. до начала визуализации. Для спектральных экспериментов FRET и иммуноблоттинга клетки высевали в пластиковые чашки для культивирования диаметром 10 см и позволяли расти до 70% слияния. Затем клетки трансфицировали 4 мкг кДНК с использованием 7,8 мкг PEI за 24 часа до начала экспериментов.

Плазмиды и клонирование

Все конструкции, используемые в этой рукописи, получены из плазмиды pKanCMV-mClover3-mRuby3 (плазмида № 74252), доступной на Addgene.org (Addgene; Уотертаун, Массачусетс). NG-mRuby3 был создан путем удаления mClover3 и всех, кроме последних 5 аминокислот линкера, из pKanCMV-mClover3-mRuby3 с помощью обратной ПЦР, а полная кодирующая последовательность mNeonGreen была вставлена ​​на ее место с помощью клонирования In-Fusion (Takara Bio; Mountain Вью, Калифорния). NG-mScarlet-I, NG-mScarlet и NG-mCherry были созданы путем удаления mRuby3 из NG-mRuby3 с помощью обратной ПЦР и вставки mScarlet-I, mScarlet или mCherry с использованием клонирования In-Fusion (Takara Bio). NG-Stop был создан с использованием того же продукта обратной ПЦР, что и NG-mScarlet-I и NG-mCherry, путем лигирования тупых концов с использованием смеси NEBs KLD (New England Biolabs; Ипсвич, Массачусетс).NG-P2A-mRuby3 был получен из NG-mRuby3 с использованием обратной ПЦР и лигирования тупых концов для вставки последовательности P2A между линкером и mRuby3. Конструкция mRuby3-GGSGG-NG была получена с использованием многофрагментной реакции In-Fusion с использованием продуктов ПЦР mRuby3 и mNeonGreen, где линкер GGSGG был присоединен к 3′-концу mRuby3 и 5′-концу продукта mNeonGreen с помощью ПЦР. mClover3-Stop был получен путем удаления mRuby3 из вектора pKanCMV-mClover3-mRuby3 с помощью обратной ПЦР и последующего лигирования тупых концов.Аминокислотные последовательности для всех описанных здесь конструкций доступны в таблице S1. Ген mNeonGreen был получен из плазмиды pmNeonGreen-NT (Allele Biotechnology; Сан-Диего, Калифорния), ген mScarlet-I был получен из плазмиды Lck-mScarlet-I (Addgene, плазмида #98821), а ген mCherry был получен из плазмиды pmCherry-N1 (Takara Bio). Продукты реакции трансформировали, подвергали скринингу и амплифицировали в XL10-Gold Ultracompetent E . клетки coli (Agilent Technologies; Санта-Клара, Калифорния).Плазмиду выделяли с использованием набора E.Z.N.A Plasmid MiniPrep Kit (Omega Bio-teck; Norcross, GA) или набора ZymoPure II Plasmid Midiprep Kit (Zymo Research; Irvine, CA) в соответствии с рекомендациями производителя. Все конструкции были проверены с помощью секвенирования по Сэнгеру (Eurofins Genomics; Луисвилл, Кентукки) и хранились в концентрации 1 мкг/мкл в морозильной камере при температуре -20°C. Все плазмиды и конструкции, созданные для этой рукописи, свободно доступны по запросу.

Спектральный ЛАД

Для спектральных экспериментов FRET клетки использовали через 24–36 часов после трансфекции.Одну 10-сантиметровую чашку клеток, экспрессирующих интересующую конструкцию, промывали буфером для визуализации (136 мМ NaCl, 560 мкМ MgCl 2 , 4,7 мМ KCl, 1 мМ Na 2 HPO 4 , 1,2 мМ CaCl 2 ). , 10 мМ HEPES, 5,5 мМ глюкозы) несколько раз и осаждали. Затем осадки клеток ресуспендировали в 500 мкл буфера для визуализации и переносили в одноразовые акрилатные кюветы (Spectrocell Inc; Ореланд, Пенсильвания). Сканирование эмиссии собирали в диапазоне 490–750 нм с использованием длины волны возбуждения 470 нм с использованием флуоресцентного спектрофотометра Cary Eclipse (Agilent Technologies).Клетки ресуспендировали энергичным пипетированием непосредственно перед сканированием. Данные собирали в программном пакете Cary Eclipse Scan Application (Agilent Technologies) и экспортировали в Microsoft Excel (Microsoft Corporation) для анализа. Чтобы оценить эффективность FRET по эмиссионным сканированиям, в Igor Pro (WaveMetrics Inc; Lake Oswego OR) было выполнено линейное разделение с использованием только донорных и только акцепторных эмиссионных сканирований для определения вклада донора и акцептора. Из-за высокого уровня согласованности между NG-Stop и зарегистрированным спектром очищенного mNeonGreen (рис. S1) очищенный спектр mNeonGreen использовался в качестве сканирования только донора для линейного разделения.Для каждого из акцепторов были созданы специальные сканы только акцептора на основе экспериментально собранных данных и их очищенного спектра (как обсуждается на рис. S1). Все необработанные сканы, использованные для спектрального FRET, доступны на рис. S1. После определения веса вклада донора и акцептора эффективность FRET оценивалась с использованием следующего уравнения [27]: (1) где E — эффективность FRET, W A и W D — массы компонентов эмиссии только донора и только акцептора, рассчитанные путем линейного разделения, а QY A и QY D — квантовый выход акцептора. и донор соответственно.

Флуоресцентная прижизненная визуализирующая микроскопия (FLIM)

Для экспериментов FLIM клетки использовали через 1 день после трансфекции, если не указано иное. За 30 минут до начала экспериментов среду заменяли буфером для визуализации и давали нагреться до комнатной температуры. Покровные стекла переносили в специально изготовленную камеру и устанавливали на предметный столик многофотонного и сканирующего конфокального микроскопа Olympus FluoView 1000-MP (Olympus; Токио, Япония). Возбуждение образцов осуществлялось с помощью фемтосекундного импульсного лазера Mai Tai Ti:Sapphire (Spectra-Physics; Санта-Клара, Калифорния), настроенного на 950 нм.Флуоресцентные затухания собирали с использованием водно-иммерсионного объектива XLPlan N 25x (NA 1,05) (Olympus) с разрешением 256×256 и временем задержки пикселя 20 мкс. Данные передавались микроскопом на установку FLIM, состоящую из двух детекторов H7422P Hamamatsu (Hamamatsu, город Хамамацу, Япония) и коррелированной по времени карты для подсчета одиночных фотонов (Becker and Hickl; Берлин, Германия). Для разделения излучения донора и акцептора использовали дихроик BrightLine FF552-Bi02-25×36 (Semrock; Rochester, NY). Свет излучения на донорный детектор дополнительно фильтровался фильтром BrightLine FF01-510/42-25, а излучение на акцепторный детектор фильтровалось фильтром BrightLine FF01-609/54-25 (Semrock).Управление микроскопом осуществлялось с помощью пакета программного обеспечения FV10-ASW (Olympus), а система FLIM управлялась с помощью пакета программного обеспечения VistaVision by ISS (ISS Inc; Шампейн, Иллинойс). Анализ затухания времени жизни одиночной ячейки был выполнен с помощью VistaVision от ISS, а последующие времена жизни были проанализированы в Microsoft Excel (Microsoft Corporation; Редмонд, Вашингтон). Вкратце, клетки выделяли в отдельные области интереса (ROI), а данные затухания для каждого пикселя в области выше порога суммировали для создания кривой затухания флуоресценции клеток.Затем эти кривые затухания были подобраны, а время жизни было извлечено с использованием нелинейной регрессии в режиме хвостовой подгонки. Почти все кривые затухания хорошо описывались одной экспоненциальной подгонкой (как определено с помощью анализа хи-квадрат, а также на глаз). Сроки службы были извлечены из этих подгонок и использованы для расчета эффективности FRET с использованием следующего уравнения [28]: (2)

Где E — эффективность FRET, 𝜏 DA — время жизни донора в присутствии акцептора, а 𝜏 D — время жизни только донорских видов (в данном случае — среднее время жизни NG-Stop) .Для экспериментов, в которых было предварительно сформировано фотообесцвечивание акцептора, клетки обесцвечивали путем сканирования лазером с длиной волны 559 нм при 100% мощности в течение 15 минут при тех же параметрах, что и данные о продолжительности жизни.

Конфокальная микроскопия

Для экспериментов по конфокальной микроскопии клетки использовали через 1 день после трансфекции. За 30 минут до начала экспериментов среду заменили буфером для визуализации и дали нагреться до комнатной температуры. Затем изображения были собраны на том же микроскопе, что и данные FLIM, с использованием сканера SIM и обычных лазерных линий 488 нм и 559 нм.Конфокальные изображения с широким полем зрения были получены через водно-иммерсионный объектив XLUMPlanF1 20X (NA 0,95) (Olympus) с разрешением 2048×2048. Образец возбуждался, и излучение собиралось в каждом канале отдельно, чтобы предотвратить просачивание. Зеленое излучение собирали через фильтр 505–540 нм, а красное излучение собирали через фильтр 575–675 нм. Все параметры изображения сохранялись одинаковыми во всех экспериментах, чтобы облегчить сравнение. Данные были собраны в пакете программного обеспечения FV10-ASW (Olympus) и экспортированы в пакет программного обеспечения Fiji [29] для анализа, как описано в основном тексте и на рис. S3, с использованием плагина Coloc2.

Иммуноблоттинг

Образцы для иммуноблоттинга собирали через 24 часа после трансфекции. Клетки удаляли из чашки для культивирования и дважды промывали DPBS, не содержащей кальция и магния (Corning). После лизиса клеток в присутствии ингибиторов протеазы концентрации белка оценивали с использованием набора для анализа белка Pierce TM BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher Scientific), и 10 мкг общего белка загружали в гель 16% SDS-PAGE. После электрофореза белки переносили в 0.Нитроцеллюлозная мембрана 2 мкм (BioRad; Hercules, CA). Присутствие белка mNeonGreen определяли с использованием моноклонального мышиного антитела против mNeonGreen [32F6] (Chromotek; Planegg-Martinsried, Германия) в разведении 1:1000 и визуализировали с помощью вторичного антитела ослиного антимышиного IgG DyLight 680 (ThermoFisher Scientific). в разведении 1:5000. Эту же мембрану дополнительно исследовали на присутствие mClover3 с использованием кроличьего антитела против GFP (ThermoFisher Scientific, A11122) в разведении 1:1000 и визуализировали с помощью вторичного антитела козы против кроличьего IgG DyLight 800 (ThermoFisher Scientific) при разведении 1 :10000 разведение.Обнаружение проводили с использованием системы визуализации Odyssey 3 (Li-cor Biosciences; Lincoln, NE).

Статистика

Чтобы избежать предположений относительно распределения данных, вся статистическая значимость в этой рукописи была определена с использованием теста перестановок, реализованного с помощью пользовательского сценария Python с использованием библиотеки MLxtend [30] с использованием метода аппроксимации с 1 000 000 перестановок. Для случаев, когда между двумя сравниваемыми наборами данных было менее 10 точек данных, использовался точный метод.

Результаты

Физические свойства и спектр белков в этом исследовании

В этом исследовании мы использовали мономерный желто-зеленый флуоресцентный белок mNeonGreen для проверки способности двух новых красных флуоресцентных белков, mRuby3 и mScarlet-I, а также mCherry действовать как акцепторы FRET. Флуоресцентные и физические свойства этих белков перечислены в таблице 1. mNeonGreen — один из самых ярких флуоресцентных белков на сегодняшний день с высоким квантовым выходом и коэффициентом экстинкции, что делает его сигналы легко наблюдаемыми.Кроме того, mNeonGreen обладает высокой фотостабильностью [4] и быстро созревает, что делает его идеальным донором FRET. И mRuby3, и mScarlet-I имеют высокие коэффициенты экстинкции, что делает их отличными акцепторами FRET. По сравнению с mCherry эти белки также обеспечивают значительно более высокий квантовый выход, что указывает на то, что будет легче обнаруживать события передачи энергии, используя излучение одного из этих двух белков. Спектр поглощения и излучения mNeonGreen наложен на спектр mRuby3, mScarlet-I и mCherry на рис. 1A–1C.Для каждого красного флуоресцентного белка значения интеграла перекрытия (J(λ)) и радиуса Ферстера (R 0 ) с mNeonGreen перечислены в таблице 1. На основании этих фотофизических свойств ожидается, что все три красных FP будут FRET с mNeonGreen. Предполагая идентичное расположение между донором и акцептором, ожидается, что mRuby3 будет давать самую высокую эффективность FRET, а mCherry — самую низкую эффективность FRET с mNeonGreen.

Рис. 1. Спектр mNeonGreen, mRuby3, mScarlet-I и mCherry.

Спектр поглощения (пунктирные линии) и излучения (сплошные линии) очищенного mNeonGreen (зеленые линии), наложенный на спектр очищенного mRuby3 (A) , mScarlet-I (B) и mCherry (C) .Спектр был получен из эталона, указанного в таблице 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g001

Тандемные конструкции

mNeonGreen-RFP показывают низкую производительность mRuby3

Чтобы проверить способность красных FP действовать как акцепторы FRET, мы сконструировали тандемные конструкции FP, состоящие из полной кодирующей последовательности mNeonGreen (NG), за которой следует короткий аминокислотный линкер (SGLSKGEE), а затем полная кодирующая последовательность красного FP (рис. 2А с последовательностями аминокислот, доступными в таблице S1 в дополнительной информации).Хотя линкер из 8 аминокислот относительно короткий, включение полного С-конца mNeonGreen (который кажется неструктурированным или отсутствует в структуре mNeonGreen [31]) создает эффективный линкер из 17 аминокислот. Также была создана конструкция mNeonGreen-Stop, которая содержит полную кодирующую последовательность mNeonGreen, линкер из 8 аминокислот, а затем стоп-кодон, чтобы действовать как контрольная конструкция только для донора. Чтобы определить, будет ли mNeonGreen FRET с красными FP в этих конструкциях, мы временно трансфицировали каждую конструкцию в клетки HEK293 и измерили эмиссию акцептора FP при возбуждении с длиной волны, которая будет возбуждать только донор.Когда клетки, экспрессирующие конструкции NG-Stop, возбуждаются светом с длиной волны 470 нм, был получен спектр, сравнимый со спектром, полученным для очищенного mNeonGreen (рис. 2B, рис. S1 в дополнительной информации). При анализе тандемных конструкций NG-red FP появляется второй пик, соответствующий красному FP. Пример спектра для конструкций NG-mRuby3, NG-mScarlet-I и NG-mCherry показан на рис. 2C, 2D и 2E соответственно розовым цветом вместе с рассчитанными донорными (зеленый) и акцепторными компонентами (красный), определенными путем линейного разделения. а также подгонку (черная пунктирная линия), полученную в результате добавления рассчитанных донорных и акцепторных компонентов.Обратите внимание, что во всех случаях подгонка без смешивания точно воспроизводила кривые необработанных данных. Используя донорные и акцепторные компоненты, эффективность FRET каждой конструкции можно оценить по уравнению 1 (рис. 2F, с необработанными трассами, доступными на рис. S1). При трех независимых трансфекциях для каждой конструкции конструкции NG-mScarlet-I и NG-mCherry показали эффективность FRET 29 ± 0,5% и 22 ± 0,8% соответственно. Удивительно, но конструкция NG-mRuby3 показала предполагаемую эффективность FRET 16 ± 0,1%.Эта низкая производительность по сравнению с NG-mScarlet-I или NG-mCherry была весьма неожиданной, учитывая физические и спектральные свойства, указанные для mRuby3 [10], которые предсказывали, что он будет лучшим акцептором FRET из трех красных FP для mNeonGreen.

Рис. 2. Спектральная FRET каждой тандемной конструкции mNeonGreen-Red FP.

(A) Мультипликационная схема тандемных конструкций mNeonGreen-Red FP, используемых для экспериментов FRET. (B) Среднее сканирование эмиссии клеток, экспрессирующих NG-Stop (черный) при возбуждении при 470 нм, наложенное на зарегистрированный спектр очищенного mNeonGreen зеленым (n = 3 независимых трансфекции).Пример необработанного спектра излучения (розовый) тандема (C) NG-mRuby3, (D) NG-mScarlet-I и (E) NG-mCherry при возбуждении на длине волны 470 нм. Черная пунктирная линия показывает сумму донорных (зеленая) и акцепторных (красная) компонентов, рассчитанная путем линейного разделения. (F) Эффективность FRET рассчитана по спектру для каждой конструкции (n = 3). *** = P < 0,0005 между указанными условиями.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g002

mNeonGreen является подходящим донором для двухфотонного FLIM

.

Чтобы подтвердить наши спектральные результаты FRET, мы обратились к более точному методу 2-Photon Fluorescent Lifetime Imaging (FLIM). Сначала мы попытались определить, является ли mNeonGreen подходящим донором для экспериментов 2-Photon FLIM. Донор FRET с хорошими характеристиками легко возбуждается 2-фотонным лазером, стабилен при различной мощности 2-фотонного лазера и демонстрирует стабильное моноэкспоненциальное время жизни [32]. Насколько нам известно, есть только один отчет о производительности mNeonGreen с использованием двухфотонного освещения[33].Это исследование продемонстрировало, что флуоресцентные белки с синим смещением, как правило, работают лучше при двухфотонном возбуждении, чем флуоресцентные белки с более желтым смещением, но это не препятствует использованию mNeonGreen в исследованиях, основанных на двухфотонах. Используя свет с длиной волны 950 нм и конструкцию NG-Stop, мы оценили эффективность mNeonGreen в двухфотонном FLIM в различных условиях, используя коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов. При различной мощности лазера mNeonGreen обеспечивал стабильное время жизни 3,05 ± 0,01 нс в течение 50 кадров сбора данных (рис. 3А).Это время жизни было стабильным до 300 кадров для всех, кроме самой высокой протестированной мощности лазера, 25 Вт/см 2 , в которой время жизни линейно уменьшалось до 87 ± 4,5% от его начального значения после 300 кадров (рис. 3B). Напротив, значительное фотообесцвечивание наблюдалось при мощности лазера выше 15 Вт/см 2 (рис. 3C), при 20 Вт/см 2 и 25 Вт/см 2 обесцвечивание приблизительно 48 ± 14% и 94 ± 3% интенсивность образца соответственно после 300 кадров. Пример следов распада одной клетки, собранных в последовательных интервалах из 50 кадров, показан при 15 Вт/см 2 (рис. 3D) и 25 Вт/см 2 (рис. 3E).Нормирование кривых затухания к пиковой интенсивности для примера 25 Вт/см 2 демонстрирует сокращение срока службы и ухудшение качества данных в процессе сбора данных при этой мощности (рис. 2F). Для сравнения мы повторили эти эксперименты с использованием EGFP (рис. S2). EGFP обеспечивал стабильное время жизни 2,63 ± 0,01 нс при различной мощности лазера. Подобно mNeonGreen, это время жизни было стабильным для 300 кадров регистрации для каждой мощности лазера, отличной от 25 Вт/см 2 .Кроме того, уровни мощности выше 15 Вт/см 2 также вызывали значительное фотообесцвечивание в течение 300 кадров, хотя и в меньшей степени, чем наблюдаемое с mNeonGreen (рис. S2). Учитывая эти данные, мы пришли к выводу, что mNeonGreen является подходящим донором для двухфотонных экспериментов FLIM, когда время жизни достигается при мощности лазера 15 Вт/см 2 или меньше. Для всех дальнейших экспериментов FLIM данные собирались при мощности лазера от 5 до 10 Вт/см 2 для 100–150 кадров в зависимости от яркости ячейки.

Рис. 3. mNeonGreen хорошо работает при различной мощности лазера для получения двухфотонных данных FLIM во временной области.

(A) Данные о продолжительности жизни, полученные из отдельных клеток HEK293, экспрессирующих цитозольный mNeonGreen, при различных мощностях лазера до 25 Вт/см 2 после 50 кадров. Черные столбцы указывают средний доверительный интервал ± 95%. (B) Время жизни и (C) интенсивность образцов, снятых на протяжении 300 кадров при различной мощности лазера. * = Р < 0,05, ** = Р < 0.005 и *** = P <0,0005 по сравнению с набором данных 5 Вт/см 2 . N для каждого образца: 5Вт/см 2 : 11 ячеек, 10Вт/см 2 : 10 ячеек, 15Вт/см 2 : 11 ячеек. (D) Пример кривых затухания за время жизни, полученных при 15 Вт/см 2 на 300 кадрах. (E) Пример затухания за время жизни и нормализованное затухание (F) получено при 25 Вт/см 2 на 300 кадрах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g003

Измерения FLIM-FRET подтверждают низкую производительность mRuby3

С помощью FLIM FRET определяется как сокращение времени жизни донора в присутствии акцептора [28]. Преимущество этого метода заключается в определении состояния FRET между mNeonGreen и красным FP независимо от излучения красных FP, что позволяет нам определить эффективность FRET для каждой конструкции без учета различий между каждыми красными FP.В ходе нескольких независимых трансфекций конструкция mNG-Stop давала время жизни только донора 3,05 ± 0,02 нс (рис. 4А). Когда в тандемах присутствуют mScarlet-I или mCherry, время жизни mNeonGreen снижается до 2,22 ± 0,06 нс и 2,23 ± 0,03 нс соответственно (рис. 4А). В результате эффективность FRET конструкции NG-mScarlet-I составляет 27 ± 2%, а эффективность конструкции NG-mCherry составляет 27 ± 1% (рис. 4B). Анализ конструкции NG-mRuby3 показывает еще худшие характеристики mRuby3, чем то, что было оценено с помощью спектрального FRET (рис. 2F).Среднее время жизни конструкции NG-mRuby3 составило 2,92 ± 0,03 нс (рис. 4А), в результате чего эффективность FRET составила всего 4 ± 0,9% (рис. 4В). Действительно, 35 клеток при 3 независимых трансфекциях (более половины всех отобранных клеток) продемонстрировали время жизни в пределах того, что было собрано для конструкции NG-Stop, тогда как ни одна клетка, экспрессирующая NG-mScarlet-I или NG-mCherry, не имела времени жизни в этом диапазоне. (рис. 4А). Примеры следов распада, представляющие среднее значение для каждой конструкции, показаны на рис. 4C, а примеры карт времени жизни клеток HEK293, экспрессирующих каждую конструкцию, показаны на рис. 4D.

Рис. 4. Срок службы тандемных конструкций mNeonGreen-Red FP.

(A) Время жизни mNeonGreen в отдельных клетках, экспрессирующих тандемную слитую конструкцию mNeonGreen-Red Protein. Черные столбцы указывают средний доверительный интервал ± 95%. (B) Расчет эффективности FRET для каждой тандемной конструкции. *** = P <0,0005 по сравнению с NG-Stop, а # означает P <0,0005 по сравнению с NG-Stop и P <0,0005 по сравнению с NG-mRuby3. NG-mScarlet-I и NG-mCherry статистически не отличаются (P = 0.75) (C) Пример кривых распада для каждого тандема, представляющего среднее время жизни всех клеток для каждой конструкции. (D) Пример тепловых карт за весь срок службы для одного кадра для каждой конструкции. N для каждой конструкции является следующим: NG-Stop: 68 клеток, NG-mRuby3: 63 клетки, NG-mScarlet-I: 64 клетки и NG-mCherry: 64 клетки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g004

Конфокальная визуализация демонстрирует более низкую, чем ожидалось, красную флуоресценцию конструкции mNeonGreen-mRuby3

Для дальнейшего изучения плохой эффективности mRuby3 в качестве акцептора FRET мы обратились к конфокальной микроскопии для анализа поведения каждой тандемной конструкции.Присутствие mNeonGreen и красных FP исследовали независимо друг от друга путем последовательного возбуждения лазерами с длиной волны 488 нм и 559 нм, при этом излучение каждого канала собиралось отдельно, чтобы предотвратить просачивание. Пример широкоугольных изображений клеток, экспрессирующих каждую конструкцию, показан на рис. 5А. Качественно на совмещенном изображении зеленого и красного каналов видно, что клетки, экспрессирующие конструкцию NG-mRuby3, имеют сильно различающиеся интенсивности зеленой и красной флуоресценции. Интересно, что регулярно наблюдались клетки, содержащие высокие уровни mNeonGreen и низкие уровни mRuby3 или наоборот, наряду с клетками, которые, по-видимому, содержали оба белка.Эта гетерогенность также была отмечена для конструкций NG-mScarlet-I и NG-mCherry, но с гораздо меньшей частотой (рис. 5А). Этот результат был весьма неожиданным, учитывая, что конструкции были разработаны для экспрессии mNeonGreen и красного FP стехиометрически и в тандеме. Теоретически можно было бы ожидать, что экспрессия таких тандемных конструкций приведет к фиксированному соотношению интенсивности зеленого и красного, где интенсивность красного изменяется в зависимости от яркости красного FP, а интенсивность зеленого изменяется в зависимости от степени FRET.Чтобы проверить это предсказание и количественно оценить неоднородность каждой конструкции, мы исследовали интересующие области (ROI), содержащие одну ячейку, извлекли интенсивность зеленого и красного для этой ячейки после вычитания фона и нанесли результирующие интенсивности на уровень пикселей. Полученные графики интенсивности зелено-красного цвета для каждой клетки затем аппроксимировались с помощью линейной регрессии. Пример этого рабочего процесса показан на рис. S3. Хотя абсолютное значение этого наклона будет разным для каждой пары флуорофоров и для разных условий визуализации, изменения этого наклона от клетки к клетке при одних и тех же условиях визуализации будут свидетельствовать о неоднородности каждой конструкции.Как и ожидалось от тандемной конструкции и на основе качественной оценки изображений (рис. 5А), гистограммы наклонов для отдельных клеток, экспрессирующих конструкции NG-mCherry и NG-mScarlet-I, показали разумное распределение и узкий разброс наклонов (рис. 5С и 5Д). Это указывает на то, что большинство клеток, экспрессирующих эти конструкции, содержат фиксированное соотношение mNeonGreen и красного FP. Напротив, гистограмма наклона клеток, экспрессирующих NG-mRuby3, не была так равномерно распределена (фиг. 5B). Действительно, большинство клеток, экспрессирующих эту конструкцию, имеют наклон, близкий к 0, что позволяет предположить, что эти клетки содержат измеримые уровни mNeonGreen, но низкие уровни флуоресцентного mRuby3.Интересно, что это отсутствие обильной красной флуоресценции не связано с отсутствием белка mRuby3, поскольку вестерн-блоттинг клеток, трансфицированных NG-mRuby3, дает такой же рисунок полос, что и клетки, трансфицированные NG-mScarlet-I и NG-mCherry (S4 Fig). Важно отметить, что в клетках, трансфицированных NG-mRuby3, нет полосы мономера меньшего размера, что указывает на то, что наши тандемные конструкции в целом не повреждены, и исключает возможность производства mNeonGreen без mRuby3. Взятые вместе, эти данные обеспечивают механистическое объяснение наших данных FLIM, в которых все клетки, экспрессирующие конструкции NG-mScarlet-I и NG-mCherry, демонстрировали устойчивый FRET, тогда как подавляющее большинство конструкций NG-mRuby3 этого не делали.Кроме того, они предполагают, что низкая производительность NG-mRuby3 может быть связана с плохим созреванием акцептора по сравнению с NG-mScarlet-I и даже NG-mCherry.

Рис. 5. Конфокальная микроскопия тандемных конструкций.

(A) Примеры изображений конструкций NG-Red FP при прямом возбуждении лазерами с длиной волны 499 или 559 нм. Гистограммы наклонов корреляций интенсивности красного/зеленого для отдельных клеток, экспрессирующих (B), NG-mRuby3 (n = 1077 клеток), (C) NG-mScarlet-I (n = 1745 клеток) и ( Г) NG-mCherry (n = 1557 клеток).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g005

mRuby3 демонстрирует аналогичное поведение в нескольких конфигурациях и аналогичное поведение медленно созревающего варианта mScarlet

.

Чтобы лучше определить, было ли поведение mRuby3 специфичным для нашей системы или присущим самому mRuby3, мы разработали несколько дополнительных тандемных конструкций. Во-первых, мы поменяли ориентацию тандема, чтобы увидеть, был ли mRuby3 более устойчивым к слияниям с С-конца, и изменили линкер на немного меньший глицин-сериновый линкер (GGSGG).Эта конструкция mRuby3-GGSGG-NG была предварительно сформирована аналогично исходной конструкции NG-mRuby3, обеспечивая среднее время жизни 2,96 ± 0,02 нс (рис. 6A), что соответствует эффективности FRET 4 ± 1% (рис. 6B). Конфокальный анализ этой конструкции (рис. 6C и 6D) также выявил фенотип, сходный с NG-mRuby3, где большинство клеток имеют наклон, близкий к 0, что указывает на то, что большинство клеток имеют обнаруживаемую флуоресценцию mNeonGreen, но не имеют флуоресценции mRuby3. Затем мы вставили оптимизированную пептидную последовательность самосплайсинга (пептид P2A) [34] между NG и mRuby3 в конструкции NG-Ruby3.Эта последовательность вызывает событие пропуска рибосомы во время трансляции, что приводит к высвобождению полипептида NG из рибосомы во время трансляции перед повторной инициацией трансляции части конструкции mRuby3, что приводит к трансляции двух отдельных белков из одного и того же транскрипта. Примечательно, что мы разработали конструкцию таким образом, что большая часть дополнительной пептидной последовательности P2A будет присоединена к NG, а единственным дополнением к mRuby3 будет N-концевой пролин после успешного расщепления. Клетки, экспрессирующие NG-P2A-mRuby3, имели среднее время жизни 3.09 ± 0,01 нс (рис. 6А) и показали время жизни, которое было статистически неотличимо от времени жизни клеток, экспрессирующих NG-Stop, собранных в тот же день. Этот результат был ожидаемым, поскольку NG и mRuby3 в этих клетках больше не должны быть связаны друг с другом, и действительно, вестерн-блот-анализ этой конструкции подтверждает, что пептид P2A расщепляется с высокой эффективностью (S4 Fig). К сожалению, несмотря на то, что эта конструкция показывает лишь незначительное улучшение поведения mRuby3, как определено с помощью конфокального анализа (рис. 6C и 6E), который по-прежнему показывает высокую долю клеток с почти нулевым наклоном, но также демонстрирует вторичный, ненулевой пик.

Рис. 6. Поведение различных mRuby3 и mScarlet, содержащих тандемные конструкции.

(A) Время жизни отдельного набора экспрессирующих клеток NG-Stop с временем жизни 2 новых тандемных конструкций, содержащих mRuby3, и конструкции, содержащей mScarlet. Черные столбцы указывают средний доверительный интервал ± 95%. *** = P <0,0005 по сравнению с NG-Stop. NG-Stop и NG-P2A-mRuby3 статистически не отличаются (P = 0,65). N для измерений времени жизни каждой конструкции является следующим: NG-Stop: 64 клетки, mRuby3-GGSGG-NG: 66 клеток, NG-P2A-mRuby3: 69 клеток и NG-mScarlet: 77 клеток. (B) Средняя эффективность FRET для каждой из новых тандемных конструкций. (C) Пример слияния конфокальных изображений клеток HEK293, экспрессирующих каждую из новых тандемных конструкций. Объединенные гистограммы наклонов клеток, экспрессирующих (D) mRuby3-GGSGG-NG, (E) NG-P2A-mRuby3 и (F) NG-mScarlet. N для конфокальных измерений каждой конструкции составляет следующее: mRuby3-GGSGG-NG: 2302 клетки, NG-P2A-mRuby3: 1548 клеток и NG-mScarlet: 1150 клеток.

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0219886.g006

В то время как mScarlet-I и mCherry созревают с периодом полураспада 36 и 15 минут соответственно, mRuby3 имеет период полусозревания 136,5 минут. Чтобы проверить, может ли большая разница во времени созревания привести к фенотипу, который мы наблюдаем для mRuby3, мы мутировали mScarlet-I в тандеме NG-Scarlet-I в яркий, но медленно созревающий вариант Scarlet, mScarlet, путем введения мутации I74T. Сообщается, что этот вариант с медленным созреванием имеет период полусозревания 132.4 минуты в тех же условиях, что и измерения созревания mRuby3. Клетки, экспрессирующие NG-mScarlet, демонстрировали сильно различающиеся времена жизни, в среднем до 2,67 ± 0,05 нс, что приводило к средней эффективности FRET 13 ± 2% (рис. 6A и 6B). В конфокальном режиме клетки, экспрессирующие этот NG-Scarlet, также демонстрируют гетерогенный фенотип (рис. 6C), но большинство клеток демонстрируют ненулевой наклон, указывающий на то, что большинство клеток проявляют как зеленую, так и красную флуоресценцию (рис. 6F).

Наконец, мы обратились к анализу поведения mRuby3 с эволюционно отличной зеленой FP, mClover3.Используя тандемную конструкцию mClover3-mRuby3, доступную от Addgene, мы создали конструкцию mClover3-Stop, которая служит только в качестве донорского контроля, и проанализировали способность mRuby3 действовать как акцептор для mClover3 с использованием FLIM. В дополнение к использованию другого зеленого FP, эта конструкция также использует линкер из 12 аминокислот, а не эффективные линкеры из 17 или 15 аминокислот, которые мы использовали до сих пор (таблица S1). Клетки, экспрессирующие mClover3-Stop, демонстрируют стабильное моноэкспоненциальное время жизни 3,11 ± 0,01 нс (рис. S5).Когда в конструкции присутствует mRuby3, действующий как акцептор, это время жизни уменьшается в среднем до 2,81 ± 0,05 нс (рис. S5). Это приводит к средней эффективности FRET 10 ± 2%. Также стоит отметить, что, как и NG-mScarlet, mClover3-mRuby3 продемонстрировал широкий диапазон времени жизни. Учитывая, что спектральные и физические свойства mClover3 очень похожи на свойства mNeonGreen, это, по-видимому, указывает на небольшое улучшение производительности mRuby3 либо из-за компоновщика сортировщика, либо из-за включения mClover3 вместо mNeonGreen.Несмотря на это, в выражении этого тандема все еще наблюдается высокая неоднородность (рис. S5), что указывает на то, что основные проблемы с mRuby3 все еще присутствуют.

Экспрессия mNeonGreen-mRuby3 в течение более длительных периодов времени повышает его производительность

Наши предыдущие данные показали, что плохие акцепторные свойства mRuby3 могут быть частично связаны с неэффективным созреванием. Чтобы проверить это дальше, мы провели эксперименты FLIM в течение пяти дней после временной трансфекции конструкцией NG-mRuby3.Как видно на рис. 7А, среднее время жизни mNeonGreen в конструкции NG-mRuby3 снижается с 2,92 ± 0,03 нс через 1 день после трансфекции (DPT) до 2,41 ± 0,09 нс через 5 дней после трансфекции. Это приводит к изменению средней эффективности FRET с 4 ± 0,9% 1 DPT на эффективность 21 ± 3% эффективности 5 трансфекции DPT (фиг. 7B). Примеры карт времени жизни отдельных клеток, экспрессирующих NG-mRuby3 2–5 DPT, показаны на рис. 7C, а пример карты времени жизни для 1 DPT показан на рис. 4D. Примеры флуоресцентных следов затухания для каждого DPT доступны на S6 Рис.С течением времени количество ячеек, демонстрирующих время жизни в пределах диапазона NG-Stop, также уменьшалось. Тем не менее, можно было наблюдать даже 5 клеток DPT, которые демонстрировали только донорское время жизни. Это указывает на то, что, хотя неэффективное созревание в клетках млекопитающих может быть одной из причин плохой работы mRuby3 в предыдущих экспериментах, это, вероятно, не единственный способствующий фактор. Чтобы гарантировать, что изменения, наблюдаемые с течением времени для конструкции NG-mRuby3, были связаны с изменениями, происходящими с белком mRuby3, а не с mNeonGreen, время жизни mNeonGreen конструкций NG-mRuby3 определяли до и после фотообесцвечивания акцептора на 5 DPT (рис. 7D). .Независимо от времени жизни каждой клетки до фотообесцвечивания акцептора, все клетки демонстрировали время жизни, сходное со временем жизни конструкции NG-Stop после фотообесцвечивания акцептора. На рис. 7F показаны примеры карт времени жизни двух клеток, экспрессирующих NG-mRuby3, через 5 дней после трансфекции до и после фотообесцвечивания акцептора, а примеры следов флуоресцентного затухания можно найти на рис. S6. Эти результаты демонстрируют, что время жизни mNeonGreen оставалось стабильным в течение 5 дней, что указывает на то, что изменения, которым подверглась конструкция NG-mRuby3, были обусловлены изменениями, происходящими с белком mRuby3.

Рис. 7. FRET NG-mRuby3 через 1–5 дней после трансфекции.

(A) Время жизни клеток, экспрессирующих конструкцию NG-mRuby3, через 1–5 дней после трансфекции (DPT) с 1 DPT воспроизведено на рис. 3A для справки. Черные столбцы указывают средний срок службы ± 95% доверительный интервал. Зеленая заливка указывает диапазон времени жизни, наблюдаемый в конструкции NG-Stop. *** = P <0,0005 по сравнению с 1 DPT и # = P <0,0005 по сравнению с 1 DPT и P <0,0005 по сравнению с предыдущим днем.N для каждого состояния является следующим: 2 DPT: 30 ячеек, 3 DPT: 34 ячейки, 4 DPT: 35 ячеек и 5 DPT: 31 ячейка. (B) Средняя эффективность FRET NG-mRuby3 1–5 DPT. (C) Пример карт жизненного цикла, собранных каждый день тестирования. (D) Данные о продолжительности жизни клеток, экспрессирующих NG-mRuby3, через 5 дней после трансфекции до и после фотообесцвечивания акцептора (n = 15). *** = P <0,0005 после фотообесцвечивания по сравнению с до фотообесцвечивания. (E) Примеры карт времени жизни одних и тех же клеток до и после фотообесцвечивания акцептора.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g007

Обсуждение

Разработка и проверка ярких мономерных пар зеленый/красный FP значительно увеличат общее распространение FRET зеленый/красный. Яркие флуорофоры обеспечивают более легкое обнаружение и большее отношение сигнал/шум. Использование зеленых и красных флуорофоров, в частности, имеет несколько явных преимуществ, включая снижение токсичности источника возбуждения, большее спектральное разделение, большие радиусы Фёрстера и лучшую проникающую способность тканей для длин волн возбуждения и излучения.Эти преимущества позволяют проводить более новые, более точные и точные исследования с меньшим количеством искажающих факторов, чем то, что можно было бы сделать с парами FRET голубого и желтого цветов. mNeonGreen — идеальный донор для экспериментов Green/Red FRET. Его смещенный в желтый цвет спектр возбуждения и излучения допускает высокую степень перекрытия с красными FP, а также способен возбуждаться синим светом с более низкой энергией, чем голубой или зеленый с голубым смещением FP. Кроме того, mNeonGreen удивительно яркий при однофотонном освещении, что облегчает наблюдение за его сигналами.Сообщается, что и mScarlet-I, и mRuby3 имеют одни из самых высоких коэффициентов экстинкции среди всех красных FP, а также являются одними из самых ярких мономерных красных FP на сегодняшний день. Эти факты указывают на то, что они должны быть отличными акцепторами FRET, что делает Green/Red FRET более доступными для исследователей. В этом исследовании мы стремились проверить это предсказание, используя различные оптические методы.

Мы проверили способность этих двух новых красных FP — mRuby3 и mScarlet-I — вместе с mCherry действовать как акцепторы FRET для mNeonGreen, используя подход с тандемным белком.Первоначально мы использовали интенсивометрический спектральный FRET для оценки эффективности FRET между mNeonGreen и красными FP (рис. 2). В этом анализе NG-mScarlet-I продемонстрировал самую высокую эффективность FRET, за ним следовал NG-mCherry, а затем NG-mRuby3 (рис. 2F). Это было удивительно, учитывая заявленные свойства mRuby3, которые предсказывали, что он будет лучшим акцептором для mNeonGreen. В частности, у mRuby3 была самая высокая степень перекрытия между его спектром возбуждения и спектром излучения mNeonGreen, и он имеет самый высокий коэффициент экстинкции среди трех красных FP в этом исследовании (таблица 1).Эти эксперименты также продемонстрировали преимущества этих более новых белков по сравнению с mCherry, поскольку mScarlet-I производил почти в 3 раза больше интенсивности, чем mCherry, несмотря на всего лишь 7%-ную разницу в расчетной эффективности, а mRuby3 производил почти в 1,5 раза больше интенсивности, чем mCherry, несмотря на NG- mRuby3 демонстрирует более низкую эффективность FRET, чем NG-mCherry. Это отражает разницу в коэффициенте экстинкции и квантовом выходе между этими двумя белками и mCherry и демонстрирует, что mScarlet-I является лучшим общим акцептором, который обеспечивает больший сигнал и больший динамический диапазон для интенсивометрических экспериментов FRET на основе зеленого и красного цветов.

Чтобы подтвердить эти результаты, мы обратились к более точному методу FLIM. Преимущество FLIM заключается в том, что необходимо наблюдать только за донором, что устраняет необходимость корректировать наши данные для различий в физических свойствах акцепторов, о которых сообщают другие. Кроме того, наша установка FLIM позволяет анализировать отдельные клетки, чтобы получить более подробный профиль поведения тандемной конструкции. После определения mNeonGreen в качестве подходящего донора для экспериментов 2-Photon FLIM (рис. 3) мы использовали этот метод для измерения эффективности FRET каждого тандема в исследовании (рис. 4).Мы обнаружили, что и mScarlet-I, и mCherry были способны эффективно FRET с mNeonGreen почти в одинаковой степени, но что mRuby3 не смог вызвать существенного FRET (рис. 4A и 4B). Было несколько удивительно видеть, что mCherry преформируется так же хорошо, как mScarlet-I, в качестве акцептора FRET в наших экспериментах FLIM, несмотря на значительно более низкий коэффициент экстинкции. Это может быть демонстрацией быстрого созревания mCherry, что может позволить создать максимально возможное количество полностью развитых тандемов.Чтобы дополнительно исследовать плохую работу mRuby3, мы использовали конфокальную микроскопию, чтобы выявить большую гетерогенность в способах экспрессии тандема NG-mRuby3 (рис. 5A и 5B), при этом многие клетки демонстрируют либо красную, либо зеленую флуоресценцию, без других. Это было несмотря на вестерн-блот-анализ, предполагающий, что большинство клеток должны экспрессировать полноразмерный тандемный белок (S4 Fig). Это поведение было одинаковым для трех дополнительных конструкций mRuby3 (рис. 6). Изменение ориентации конструкций и укорочение линкера между ними (Ruby3-GGSGG-NG), по-видимому, практически не повлияло на эффективность mRuby3 в качестве акцептора или на наблюдаемую гетерогенность при конфокальном воздействии (рис. 6).Лишь незначительные улучшения наблюдались при конфокальном контакте с конструкцией NG-P2A-mRuby3, которая позволяла mRuby3 созревать без ковалентной связи с NG (конформация, которая предотвращала FRET, но позволяла нам оценить поведение mRuby3 как независимого белка). Примечательно, что это поведение было похоже на то, что наблюдалось с медленно созревающим вариантом Scarlet, mScarlet (рис. 6), что позволяет предположить, что плохая производительность mRuby3 может быть связана с более длительным временем созревания. Учитывая эти данные, были проведены эксперименты с конструкцией NG-mRuby3 через несколько дней после трансфекции, и действительно было обнаружено, что предоставление конструкции NG-mRuby3 большего времени для созревания улучшило ее характеристики в качестве акцептора FRET (рис. 7).

Теоретически более высокий коэффициент экстинкции и квантовый выход mRuby3 предсказывают, что он должен превзойти mCherry и mScarlet-I. Поразительно, однако, мы обнаружили противоположный результат (рис. 2 и рис. 4). Даже в самых идеальных испытанных условиях (через 4 или 5 дней после трансфекции) тандем NG-mRuby3 все еще не достиг эффективности FRET тандемов NG-mScarlet-I и NG-mCherry (рис. 7). Это контрастирует с предыдущим отчетом о том, что аналогичная конструкция mNeonGreen-mRuby3 очень хорошо преформируется, достигая почти 40% эффективности как в клетках HEK293, так и в клетках Hela [10].На данный момент причины этого несоответствия неясны, хотя сходство длины и состава линкера, времени трансфекции и типов клеток предполагает, что это не связано с различием в составе используемых тандемных конструкций или различиями в условиях, в которых были проведены эксперименты (для каких условий сообщалось). Это несоответствие также проявилось в конструкции mClover3-mRuby3 (S5 Fig), опять же, по неизвестным причинам. Кроме того, в ходе наших экспериментов мы обнаружили, что спектр излучения mRuby3 в этом тандеме был немного сдвинут влево на 6 нм по сравнению с тем, о чем сообщается очищенным mRuby3[10] (S1 Fig).Об этом открытии ранее не сообщалось, и, хотя это смещение было небольшим, его необходимо было скорректировать, чтобы правильно подобрать наши данные. Причина этого спектрального сдвига остается неясной, но может быть просто результатом того, что поведение mRuby3 в клетках немного отличается от поведения в очищенной системе. Это также может быть связано с фотохромным поведением, о котором ранее сообщалось для mRuby3 [11]. Какой бы ни была причина, непредсказуемые изменения спектра очень важны для экспериментов FRET, поскольку они могут привести к изменениям интенсивности флуоресценции, которые могут быть неверно истолкованы как изменения в состоянии FRET.Возможно, это поведение также повлияло на наши спектральные эксперименты FRET (рис. 2) и могло объяснить несоответствие между рассчитанной эффективностью FRET для конструкции NG-mRuby3 в спектральных анализах FRET и FLIM.

Хотя на сегодняшний день опубликовано несколько исследований с использованием mRuby3, исследования с использованием его предшественника, mRuby2, дают в целом положительные результаты [4, 9–11, 35, 36]. Тем не менее, исследование, аналогичное нашему, с использованием зеленого FP mClover в качестве донора, показало гораздо более низкую, чем ожидалось, эффективность при использовании mRuby2 в качестве акцептора [37].Общим между нашим и их исследованием является использование клеточных линий млекопитающих. Это в сочетании с нашими данными, представленными здесь, позволяет предположить, что плохая или медленная эффективность созревания серии Ruby является основным фактором низкой производительности mRuby3 через 1–3 дня после трансфекции. Проблемы созревания также могут сочетаться с вариабельностью скорости обмена белка от клетки к клетке или проблемами стабильности белка, и сочетание этих факторов, вероятно, объясняет высокую степень гетерогенности, которую мы наблюдаем в конфокальном режиме с нашими конструкциями mRuby3, а также с медленно созревающим вариантом. mScarlet (рис. 5 и рис. 6).

В целом мы обнаружили, что и mCherry, и mScarlet-I действуют как отличные акцепторы для mNeonGreen в нашей модельной системе, при этом каждый белок предлагает определенные преимущества в зависимости от используемых систем обнаружения. Кроме того, мы продемонстрировали, как факторы, выходящие за рамки классически рассматриваемых параметров FRET (квантовый выход донора, спектральное перекрытие и коэффициент экстинкции акцептора), могут непредсказуемым образом влиять на системы FRET. Именно один из этих «неклассических» факторов, время созревания, заставляет нас сделать вывод о том, что использование mRuby3 (и, возможно, медленно созревающего mScarlet) следует проводить с крайней осторожностью, когда мы столкнулись с недостатками (гетерогенное выражение и плохая производительность). вскоре после начала выражения) будут смягчены или перевесены потенциальными преимуществами mRuby3.Также важно учитывать, что каждый из этих белков может вести себя по-разному в разных системах. Это остается возможным объяснением различий между нашими данными и данными, представленными другими, и наши противоречивые данные подчеркивают важность хорошо продуманного тестирования и контроля, особенно при разработке более сложной системы FRET.

Заключение

В этом исследовании мы проверяем жизнеспособность mNeonGreen в качестве донора FRET и mRuby3, mScarlet-I и mCherry в качестве акцепторов FRET с тандемной модельной системой FP.Мы обнаружили, что mNeonGreen хорошо работает в качестве донора FRET как в тензиометрических, так и в двухфотонных экспериментах FLIM. При тестировании красных FP в качестве акцепторов для mNeonGreen мы обнаружили, что и mScarlet-I, и mCherry легко могут FRET с mNeonGreen. Эти белки одинаково хорошо показали себя в экспериментах FLIM, но mScarlet-I превзошел mCherry в тензиометрическом исследовании из-за его более высокого квантового выхода. Однако, когда обнаружение FRET измеряется независимо от интенсивности излучения акцептора, например, в нашей системе FLIM, mCherry демонстрирует одинаковую эффективность FRET, но более последовательное выражение, что делает его лучшим выбором по сравнению с mScarlet-I в этом сценарии.Напротив, мы обнаружили, что mRuby3 плохо работает в качестве акцептора FRET в нашей модельной системе, несмотря на то, что предсказано, что он будет лучшим акцептором FRET из трех белков. Основным фактором такой низкой производительности является медленное созревание mRuby3, хотя стабильность белка и межклеточная гетерогенность в обмене белка также могут способствовать или усугублять эту проблему.

В целом мы обнаружили, что mNeonGreen является отличным донором зелено-желтого, а mScarlet-I является одним из лучших универсальных акцепторов для экспериментов FRET зелено-красного с использованием флуоресцентных белков.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Построение эмиссионных сканов, используемых для спектрального FRET.

(A) Сканирование излучения нескольких независимых трансфекций NG-Stop при возбуждении на длине волны 470 нм, наложенное на зарегистрированное излучение чистого mNeonGreen. Среднее значение этих сканирований показано на рис. 2B. Из-за согласованности NG-Stop с чистым спектром mNeonGreen чистый спектр mNeonGreen использовался в качестве донорного спектра для линейного разделения. Сканирование эмиссии акцептора от нескольких независимых трансфекций (B) NG-mRuby3, (D) NG-mScarlet-I и (F) NG-mCherry, достигнутых путем непосредственного возбуждения акцептора с использованием света 530 и 540 нм, накладывается на сообщаемый чистый спектр для красного FP в каждом состоянии.Среднее значение каждого состояния показано рядом с отчетным чистым спектром для каждого акцептора, показанным в (C) , (E) и (G) соответственно. Сканирование как mScarlet-I, так и mCherry в конструкциях NG-mScarlet-I и NG-mCherry точно воспроизводило подъем и пик очищенных mScarlet-I и mCherry, при этом основное различие между наблюдаемым спектром и спектром чистого белка заключалось в более быстром затухании хвост спектра на высоких длинах волн. Напротив, сканирование mRuby3 в конструкции NG-mRuby3 выявило спектр испускания, который был сдвинут на 6 нм по сравнению с тем, что сообщалось для очищенного mRuby3.Из-за различий, наблюдаемых с каждым из красных акцепторных белков и различных уровней фона, были созданы специальные спектры излучения акцептора, которые служат в качестве излучения акцептора для линейного смешения, показанного на (C), , (E), и ( G) в виде черной пунктирной линии. Показаны необработанные трассировки, использованные для определения эффективности (H) NG-mRuby3, (I) NG-mScarlet-I и (J) NG-mCherry, соответствующие графику эффективности на рис. 2F.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s001

(TIF)

S2 Рис. Производительность EGFP при двухфотонной визуализации FLIM.

(A) Данные о продолжительности жизни, полученные из отдельных клеток HEK293, экспрессирующих цитозольный EGFP, при различной мощности лазера до 25 Вт/см 2 после 50 кадров. Черные столбцы указывают средний доверительный интервал ± 95%. (B) Время жизни и (C) интенсивность образцов, снятых на протяжении 300 кадров при различной мощности лазера.* = P < 0,05, ** = P < 0,005 и *** = P < 0,0005 по сравнению с набором данных 5 Вт/см 2 . N для каждого образца: 5Вт/см 2 : 10 ячеек, 10Вт/см 2 : 10 ячеек, 15Вт/см 2 : 10 ячеек.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s002

(TIF)

S4 Рис. Иммуноблот тандемных конструкций NG-Stop и NG-Red FP.

10 мкг общего белка, полученного из клеток, временно трансфицированных данной конструкцией, через один день после трансфекции загружали в 16% гель SDS-PAGE и mNeonGreen визуализировали с использованием антител (A), против mNeonGreen и (B) анти-GFP (для обнаружения конструкций, содержащих mClover3).NG-Stop имеет полосу, близкую к расчетной молекулярной массе 27 кДа. Каждый из тандемов, за исключением NG-P2A-mRuby3, показывает яркую полосу при полной прогнозируемой массе тандемных конструкций, 54 кДа. Важно отметить, что только NG-Stop и NG-P2A-mRuby3 показывают полосы, соответствующие мономерному mNeonGreen. NG-mCherry, NG-mScarlet-I, NG-mScarlet и mClover3-mRuby3 показывают продукты между ожидаемым полным тандемом и мономером mNeonGreen, которые, вероятно, связаны с гидролизом остова красных FP во время лизиса клеток и последующей денатурацией белка, что ранее сообщалось о DsRed, подобном красным FP [38].Обратите внимание, что полоса, которая появляется между 75 и 100 кДа в (A) , присутствует на всех дорожках, указывая на то, что она является неспецифической мишенью антитела mNeonGreen.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s004

(TIF)

S5 Рис. Производительность mRuby3 в качестве акцептора FRET для GFP, подобного зелено-желтому FP mClover3.

(A) Конфокальное изображение слияния клеток HEK293, экспрессирующих mClover3-mRuby3, демонстрирует, что mClover3-mRuby3 также демонстрирует высокую гетерогенность экспрессии, аналогичную тому, что наблюдалось с другими конструкциями mRuby3.(B) Время жизни клеток HEK293, экспрессирующих mClover3-Stop (условие только для донора) и mClover3-mRuby3. Каждый символ представляет измерение одной ячейки. Черные столбцы указывают средний доверительный интервал ± 95%. N для каждого образца составляет следующее: mClover3-Stop: 65 клеток и mClover3-mRuby3: 71 клетка. *** = P <0,0005 по сравнению с mClover3-Stop. (C) Средняя эффективность FRET mClover3-mRuby3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s005

(TIF)

S6 Рис.Пример кривых затухания из временного ряда NG-mRuby3.

(A) Пример кривых затухания флуоресценции отдельных клеток, экспрессирующих NG-mRuby3, через 2–5 дней после трансфекции (DPT), представляющих среднее значение для каждого состояния. Кривая NG-Stop и кривые NG-mRuby3 1 DPT на рис. 3C также показаны для справки. (B) Пример кривых затухания флуоресценции одной клетки, экспрессирующей NG-mRuby3 5 DPT, до и после фотообесцвечивания акцептора. Кривая NG-Stop с рис. 3C повторяется здесь для справки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s006

(TIF)

S1 Таблица. Аминокислотные последовательности конструкций, используемых в этой рукописи.

Аминокислотные последовательности с цветовой кодировкой для каждой конструкции показаны выше. Для NG-P2A-mRuby3 сайт расщепления находится между остатками глицина и пролина, обнаруженными непосредственно перед последовательностью mRuby3, и обозначен символом |.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s008

(TIF)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Дэвида Юла и Эндрю Войтовича за полезные комментарии в ходе исследования, а также щедрое предоставление оборудования.

Каталожные номера

  1. 1. Прашер Д.К., Экенроде В.К., Уорд В.В., Прендергаст Ф.Г., Кормье М.Дж. Первичная структура зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria. Ген. 1992;111(2):229–33. пмид:1347277
  2. 2. Мац М.В., Фрадков А.Ф., Лабас Ю.А., Савицкий А.П., Зарайский А.Г., Маркелов М.Л., и соавт. Флуоресцентные белки небиолюминесцентных видов Anthozoa. Природная биотехнология. 1999;17(10):969–73. пмид:10504696
  3. 3. Виденманн Дж., Шенк А., Рокер С., Жирод А., Шпиндлер К.Д., Ниенхаус Г.Ю.Дальнекрасный флуоресцентный белок с быстрым созреванием и пониженной тенденцией к олигомеризации из Entacmaea quadricolor (Anthozoa, Actinaria). Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(18):11646–51. Эпб 2002/08/20. пмид:12185250; Центральный PMCID в PubMed: PMC129323.
  4. 4. Shaner NC, Lambert GG, Chammas A, Ni Y, Cranfill PJ, Baird MA, et al. Яркий мономерный зеленый флуоресцентный белок, полученный из Branchiostoma lanceolatum. Природные методы. 2013;10(5):407–9. Эпб 2013/03/26. пмид: 23524392; Центральный PMCID в PubMed: PMC3811051.
  5. 5. Алие Н., Фаббретти А., Лупиди Г., Цекоа Т., Спурио Р. Разработка цветовых вариантов зеленого флуоресцентного белка (GFP) для термостабильности, чувствительности к рН и улучшенной кинетики сворачивания. Прикладная микробиология и биотехнология. 2015;99(3):1205–16. Эпб 13.08.2014. пмид: 25112226.
  6. 6. Шейнер Н.К., Кэмпбелл Р.Е., Штайнбах П.А., Гипманс Б.Н., Палмер А.Е., Цзянь Р.Ю. Улучшенные мономерные красные, оранжевые и желтые флуоресцентные белки, полученные из Discosoma sp. красный флуоресцентный белок.Природная биотехнология. 2004;22(12):1567–72. Эпублик 24 ноября 2004 г. пмид: 15558047.
  7. 7. Бейл В., Нуссоме Л., Бхат Р.А. Комбинация нового мутантного зеленого флуоресцентного белка TSapphire и варианта DsRed mOrange для создания универсального анализа FRET-FLIM in planta. Физиология растений. 2008;148(1):51–60. Эпб 2008/07/16. пмид: 18621983; Центральный PMCID в PubMed: PMC2528103.
  8. 8. Кредель С., Освальд Ф., Ниенхаус К., Дойшле К., Рокер С., Вольф М. и др. mRuby — яркий мономерный красный флуоресцентный белок для мечения субклеточных структур.ПЛОС Один. 2009;4(2):e4391. Эпб 2009/02/06. пмид: 19194514; Центральный PMCID в PubMed: PMC2633614.
  9. 9. Lam AJ, St-Pierre F, Gong Y, Marshall JD, Cranfill PJ, Baird MA, et al. Улучшение динамического диапазона FRET с помощью ярко-зеленых и красных флуоресцентных белков. Природные методы. 2012;9:1005. https://www.nature.com/articles/nmeth.2171#дополнительная информация. пмид:22961245
  10. 10. Bajar BT, Wang ES, Lam AJ, Kim BB, Jacobs CL, Howe ES, et al. Улучшение яркости и фотостабильности зеленых и красных флуоресцентных белков для визуализации живых клеток и отчетности FRET.Научные отчеты. 2016;6:20889. https://www.nature.com/articles/srep20889#дополнительная информация. пмид:26879144
  11. 11. Bindels DS, Haarbosch L, van Weeren L, Postma M, Wiese KE, Mastop M, et al. mScarlet: яркий мономерный красный флуоресцентный белок для визуализации клеток. Природные методы. 2017;14(1):53–6. Эпублик 22.11.2016. пмид: 27869816.
  12. 12. Родригес Э.А., Кэмпбелл Р.Е., Лин Дж.Ю., Лин М.З., Мияваки А., Палмер А.Е. и соавт. Набор инструментов для выращивания и свечения флуоресцентных и фотоактивных белков.Тенденции биохимических наук. 2017;42(2):111–29. Эпублик 2016/11/07. пмид: 27814948; Центральный PMCID в PubMed: PMC5272834.
  13. 13. Кремерс Г.Дж., Гилберт С.Г., Крэнфилл П.Дж., Дэвидсон М.В., Пистон Д.В. Флуоресцентные белки с первого взгляда. Журнал клеточной науки. 2011;124(2):157–60. пмид:21187342
  14. 14. Чудаков Д.М., Мац М.В., Лукьянов С., Лукьянов К.А. Флуоресцентные белки и их применение в визуализации живых клеток и тканей. Физиологические обзоры. 2010;90(3):1103–63.пмид: 20664080.
  15. 15. Ламберт Т.Дж. FPbase: редактируемая сообществом база данных флуоресцентных белков. Природные методы. 2019;16(4):277–8. пмид:30886412
  16. 16. Гринвальд Э.К., Мехта С., Чжан Дж. Генетически закодированные флуоресцентные биосенсоры освещают пространственно-временную регуляцию сигнальных сетей. Химические обзоры. 2018;118(24):11707–94. пмид:30550275
  17. 17. Фогель С.С., Талер С., Кушик С.В. Причудливый ЛАД. Наука STKE: среда знаний о преобразовании сигналов.2006; 2006 (331): re2. Эпублик 20.04.2006. пмид: 16622184.
  18. 18. Wall AC, Gius JP, Buglewicz DJ, Banks AB, Kato TA. Окислительный стресс и эндоредупликация, вызванные воздействием синего света на клетки СНО. Мутационные исследования. 2019;841:31–5. Эпаб 2019/05/30. пмид:31138408.
  19. 19. Шибуя К., Онодера С., Хори М. Токсичная длина волны синего света меняется по мере роста насекомых. ПЛОС Один. 2018;13(6):e0199266. Эпаб 2018/06/20. пмид: 29920536; Центральный PMCID в PubMed: PMC6007831.
  20. 20.Arthaut LD, Jourdan N, Mteyrek A, Procopio M, El-Esawi M, d’Harlingue A, et al. Индуцированное синим светом накопление активных форм кислорода является следствием криптохромного фотоцикла дрозофилы. ПЛОС Один. 2017;12(3):e0171836. Эпб 2017/03/16. пмид: 28296892; Центральный PMCID в PubMed: PMC5351967.
  21. 21. Наканиси-Уэда Т., Мадзима Х.Дж., Ватанабэ К., Уэда Т., Индо Х.П., Суэнага С. и др. Воздействие синего светодиодного света развивает внутриклеточные активные формы кислорода, перекисное окисление липидов и последующие клеточные повреждения в культивируемых клетках пигментного эпителия сетчатки крупного рогатого скота.Свободнорадикальные исследования. 2013;47(10):774–80. пмид:23898883
  22. 22. Jou MJ, Jou SB, Guo MJ, Wu HY, Peng TI. Генерация митохондриальных активных форм кислорода и увеличение кальция, вызванное видимым светом в астроцитах. Энн Н.Ю. Академия наук. 2004;1011:45–56. Эпб 2004/05/06. пмид: 15126282.
  23. 23. Сигел А.П., Бэрд М.А., Дэвидсон М.В., Дэй Р.Н. Сильные и слабые стороны недавно сконструированных красных флуоресцентных белков, оцененных в живых клетках с использованием флуоресцентной корреляционной спектроскопии.Международный журнал молекулярных наук. 2013;14(10):20340–58. Эпублик 17.10.2013. пмид: 24129172; Центральный PMCID в PubMed: PMC3821618.
  24. 24. Шемякина И.И., Ермакова Г.В., Крэнфилл П.Дж., Бэрд М.А., Эванс Р.А., Соуслова Е.А., и соавт. Мономерный красный флуоресцентный белок с низкой цитотоксичностью. Связь с природой. 2012;3:1204. https://www.nature.com/articles/ncomms2208#дополнительная информация. пмид:23149748
  25. 25. Хоффман РМ. Глава одиннадцатая — Визуализация живых клеток у живых животных с помощью флуоресцентных белков.В: Conn PM, редактор. Методы в энзимологии. 506: Академическая пресса; 2012. с. 197–224. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-3-7.00035-4 pmid:22341226
  26. 26. Кэмпбелл Р.Е., Тур О., Палмер А.Е., Стейнбах П.А., Бэрд Г.С., Захариас Д.А. и др. Мономерный красный флуоресцентный белок. Труды Национальной академии наук. 2002;99(12):7877–82. пмид:12060735
  27. 27. Линь Ф., Чжан С., Ду М., Ван Л., Май З., Чен Т. Превосходная надежность метода ExEm-spFRET по сравнению с методом IIem-spFRET при измерении FRET на живых клетках.Журнал микроскопии. 2018;272(2):145–50. Эпублик 20.10.2018. пмид:30338530.
  28. 28. Кошик С.В., Чен Х., Талер С., Пуль Х.Л., 3-й, Фогель С.С. Эталонные стандарты Cerulean, Venus и VenusY67C FRET. Biophys J. 2006;91(12):L99–l101. Эпублик 17.10.2006. пмид: 17040988; Центральный PMCID в PubMed: PMC1779932.
  29. 29. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frize E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T, et al. Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений. Природные методы.2012;9(7):676–82. Эпб 2012/06/30. пмид: 22743772; Центральный PMCID в PubMed: PMC3855844.
  30. 30. Raschka S. MLxtend: Предоставление утилит машинного обучения и обработки данных, а также расширений для стека научных вычислений Python. Журнал программного обеспечения с открытым исходным кодом. 2018;3(24).
  31. 31. Клавель Д., Готхард Г., фон Штеттен Д., Де Санктис Д., Паскье Х., Ламберт Г.Г. и др. Структурный анализ яркого мономерного желто-зеленого флуоресцентного белка mNeonGreen, полученного методом направленной эволюции.Acta crystallographica Раздел D, Структурная биология. 2016; 72 (часть 12): 1298–307. Эпублик 2016/12/06. пмид: 27
  32. 0; Центральный PMCID в PubMed: PMC5137226.
  33. 32. Padilla-Parra S, Auduge N, Lalucque H, Mevel JC, Coppey-Moisan M, Tramier M. Количественное сравнение различных пар флуоресцентных белков для быстрого сбора данных FRET-FLIM. Биофиз Дж. 2009; 97 (8): 2368–76. Эпублик 22.10.2009. пмид: 19843469; Центральный PMCID в PubMed: PMC2764072.
  34. 33. Молина Р.С., Тран Т.М., Кэмпбелл Р.Е., Ламберт Г.Г., Салих А., Шейнер Н.К. и др.Гомологи зеленого флуоресцентного белка со смещением в синий цвет ярче, чем усиленный зеленый флуоресцентный белок при двухфотонном возбуждении. Журнал писем по физической химии. 2017;8(12):2548–54. пмид:28530831
  35. 34. Ким Дж. Х., Ли С. Р., Ли Л. Х., Пак Х. Дж., Пак Дж. Х., Ли К. И. и др. Высокая эффективность расщепления пептида 2А, полученного из свиного тешовируса-1, в клеточных линиях человека, рыбок данио и мышей. ПЛОС Один. 2011;6(4):e18556. Эпб 2011/05/24. пмид: 21602908; Центральный PMCID в PubMed: PMC3084703.
  36. 35. Mastop M, Bindels DS, Shaner NC, Postma M, Gadella TWJ Jr., Goedhart J. Характеристика спектрально разнообразного набора флуоресцентных белков в качестве акцепторов FRET для mTurquoise2. Научный доклад 2017; 7 (1): 11999. Эпаб 2017/09/22. пмид: 28931898; Центральный PMCID в PubMed: PMC5607329.
  37. 36. Джордж Абрахам Б., Саркисян К.С., Мишин А.С., Сантала В., Ткаченко Н.В., Карп М. Пары FRET на основе флуоресцентных белков с улучшенным динамическим диапазоном для измерения времени жизни флуоресценции.ПЛОС Один. 2015;10(8):e0134436. Эпб 2015/08/04. пмид: 26237400; Центральный PMCID в PubMed: PMC4523203.
  38. 37. Martin KJ, McGhee EJ, Schwarz JP, Drysdale M, Brachmann SM, Stucke V, et al. Прием от лучшего донора; анализ пар флуоресцентных белков долгоживущих доноров для оптимизации динамических экспериментов FRET на основе FLIM. ПЛОС Один. 2018;13(1):e0183585. Эпб 2018/01/03. пмид: 29293509; Центральный PMCID в PubMed: PMC5749721.
  39. 38. Гросс Л.А., Бэрд Г.С., Хоффман Р.К., Болдридж К.К., Цзянь Р.Ю.Структура хромофора в DsRed, красном флуоресцентном белке коралла. Труды Национальной академии наук. 2000;97(22):11990–5. пмид:11050230

FRET Визуализация концентрации гемоглобина в эритроцитах, инфицированных Plasmodium falciparum

Аннотация

Фон

Во время цикла внутриэритроцитарного бесполого размножения Plasmodium falciparum потребляет до 80% гемоглобина клетки-хозяина, что значительно превышает его метаболические потребности.Модель гомеостаза эритроцитов, инфицированных falciparum, предложила объяснение, основанное на необходимости снижения коллоидно-осмотического давления внутри клетки-хозяина для предотвращения ее преждевременного лизиса. Критически важным для этой гипотезы было то, что концентрация гемоглобина в клетке-хозяине постепенно снижалась, начиная со стадии трофозоита.

Методология/основные выводы

Описанные здесь эксперименты были разработаны для проверки этой гипотезы путем прямого измерения концентрации гемоглобина в живых инфицированных эритроцитах.Мы разработали новый неинвазивный метод количественного определения концентрации гемоглобина в отдельных клетках, основанный на переносе энергии резонанса Фёрстера между молекулами гемоглобина и флуорофором кальцеином. Визуализация времени жизни флуоресценции позволила количественно определить концентрацию гемоглобина в клетках. Среднее время жизни флуоресценции неинфицированных когорт составило 270 ± 30 пс (среднее значение ± стандартное отклонение; N   =   45). В цитоплазме инфицированных клеток время жизни флуоресценции кальцеина варьировало от 290±20 пс для клеток с паразитами кольцевой стадии до 590±13 пс и 1050±60 пс для клеток с молодыми трофозоитами и поздними трофозоитами/ранними шизонтами соответственно.Это было эквивалентно снижению концентрации гемоглобина в диапазоне от 7,3 до 2,3 мМ в соответствии с предсказаниями модели. Неожиданным дополнительным открытием было существование микродомена под мембраной клетки-хозяина с пониженным тушением кальцеина гемоглобином в клетках со зрелыми паразитами на стадии трофозоита.

Выводы/значимость

Результаты подтверждают предсказания коллоидно-осмотической гипотезы и обеспечивают лучшее понимание гомеостаза эритроцитов, инфицированных малярией.Кроме того, они выявили наличие отчетливого периферического микродомена в клетке-хозяине с ограниченным доступом к молекулам гемоглобина, что указывает на концентрацию значительного количества материала, экспортируемого паразитами.

Образец цитирования: Эспозито А., Тифферт Т., Мауриц Дж.М.А., Шлахтер С., Баннистер Л.Х., Камински С.Ф. и др. (2008) Визуализация FRET концентрации гемоглобина в Plasmodium falciparum — инфицированных эритроцитах. ПЛОС ОДИН 3(11): е3780. https://дои.org/10.1371/journal.pone.0003780

Редактор: Джоэл М. Шнур, Университет Джероджа Мейсона, Соединенные Штаты Америки

Поступила в редакцию: 16 сентября 2008 г.; Принято: 28 октября 2008 г .; Опубликовано: 21 ноября 2008 г.

Copyright: © 2008 Esposito et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана фондами EPSRC (EP/E059384) и BBSRC (BB/E008542/1).

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Plasmodium falciparum ( Pf ) вызывает самую тяжелую форму малярии. По оценкам, более одной трети населения земного шара находится в группе риска [1]. Во время цикла внутриэритроцитарного бесполого размножения, длящегося около 48 часов, паразит вызывает серьезные изменения в метаболизме и транспорте инвазированных эритроцитов (эритроцитов) [2], [3].Предыдущий анализ гомеостаза инфицированных эритроцитов (IRBC) с использованием математической модели, разработанной ad hoc , в сочетании с экспериментальными результатами, показывающими, что осмотическая хрупкость IRBC постепенно увеличивается на протяжении бесполого цикла, позволяет предположить, что IRBC склонны к к преждевременному гемолизу, и что паразит может предотвратить лизис, снижая коллоидно-осмотическое давление внутри клетки-хозяина [4]. Хорошо известно, что Plasmodium falciparum потребляет до 70–80% гемоглобина (Hb) клетки-хозяина [5], но использует только до 16% продуцируемых аминокислот для синтеза белка de novo [6]. .Основная часть аминокислот высвобождается во внеклеточную среду через «новые пути проникновения» (НПП), присутствующие в мембране клетки-хозяина и индуцируемые паразитом [2], [3]. Согласно «коллоидно-осмотической» гипотезе [4], [7], причина, по которой паразит поглощает и переваривает гемоглобин в таком избытке, заключается в снижении коллоидно-осмотического давления внутри хозяина и, таким образом, предотвращении преждевременного лизиса. Чтобы эта гипотеза была обоснованной, важно, чтобы не только содержание Hb в IRBC уменьшалось, но и его концентрация ([Hb]), поскольку коллоидный осмос определяется градиентом концентрации непроницаемых растворенных веществ на водопроницаемом слое. мембрана эритроцитов.Предыдущие косвенные оценки [Hb] дали противоречивые результаты. Электронная плотность материала в цитоплазме эритроцитов хозяина, предположительно отражающая концентрацию гемоглобина, на электронно-микроскопических снимках эритроцитов была обнаружена разными авторами либо идентичной [8], либо ниже, чем у соседних неинфицированных эритроцитов [9], без какое-либо ясное методологическое объяснение этой разницы. Измерения в живых необработанных образцах явно предпочтительнее для оценки концентрации, на которую могут повлиять процедуры обработки образцов, которые могут по-разному изменять объемы клеток в клетках с нормальной и измененной проницаемостью.

Мы сообщаем здесь о прямых измерениях концентрации Hb в цитозоле живых IRBC с использованием нового метода, основанного на визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM), для проверки достоверности коллоидно-осмотической гипотезы. Из-за спектральных характеристик гемового хромофора [8] гемоглобин является мощным гасителем любого флуорофора со спектрами флуоресценции, достигающими пика ниже 600 нм. Мы предполагали, что основной причиной тушения флуоресценции может быть резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) от донорного флуорофора (кальцеин в этой работе) к акцепторному гемовому хромофору, вызванный скоплением молекул гемоглобина.FLIM сочетает в себе высокое пространственное разрешение схемы конфокального обнаружения, необходимое для различения компартментов хозяина и паразита, с высоким разрешением времени жизни флуоресценции, обеспечиваемым коррелированным по времени подсчетом одиночных фотонов (TCSPC) [9]. Такая комбинация необходима для охвата соответствующего диапазона концентрации гемоглобина (2–7 мМ) с достаточным пространственным разрешением. Картирование поглощения Hb в инфицированных эритроцитах может оказаться подходящей альтернативой для количественного определения [Hb]. Однако необходимость одновременной оценки толщины клеток в каждом пикселе вместе с требованием однозначно различать компартменты RBC и Pf с достаточным разрешением делает этот подход менее практичным в настоящее время.FRET-изображение с помощью FLIM является одним из наиболее надежных методов обнаружения молекулярных взаимодействий со сравнительно высоким пространственным разрешением [10], [11], что делает этот метод предпочтительным для количественного определения [Hb] в живых клетках.

Результаты

Предсказания модели

На рис. 1 показаны прогнозируемые изменения [Hb] (рис. 1А) и относительного объема клеток (рис. 1В) IRBC в зависимости от времени после вторжения. Различные кривые исследуют значения параметров в пределах стандартного отклонения (SD) от средних значений, указанных в литературе [6], [12].Варьировались четыре параметра: среднее время появления НПП или t 1/2 (НПП), среднее время переваривания Hb или t 1/2 (Hb), исходная концентрация гемоглобина и максимальная доля переваренного гемоглобина. Огибающие кривых, серые на рис. 1А и цветные на рис. 1В, представляют 99% процентили совместного распределения для четырех параметров. Кроме того, на рис. 1В показан эффект изменения роста объема паразита, смоделированный путем корректировки значения коэффициента связи ( cf ), который связывает объем проглоченного цитозоля с объемом паразита [7].

Рисунок 1. Прогнозируемые изменения [Hb] ( A ) и относительного объема клеток (B) в зависимости от времени после вторжения.

Различные кривые отражают изменения значений параметров в пределах ±1 SD от экспериментально зарегистрированных значений: t 1/2 (АЭС) и t 1/2 (Hb) варьировались в диапазоне 27±5 часов [12] и 32±6 часов [6] соответственно; начальная концентрация гемоглобина и максимальная доля переваренного гемоглобина были установлены на уровне 6,8±0,5 мМ и 80±10% [5] соответственно.Коэффициент связи ( cf ) между объемом проглоченного паразитом цитозоля и его объемом-ростом был установлен на уровне 0,30, 0,65 и 1,00. Вертикальный столбец выделяет период от 32 до 40 часов после вторжения анализируемых здесь образцов клеток. Объем указывается относительно исходного объема эритроцитов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003780.g001

Согласно прогнозам модели, вертикальная черта выделяет период роста зрелого паразита с высокой вероятностью обнаружения существенного снижения концентрации Hb в клетке-хозяине. цитоплазма (рис.1А) от нормальных значений около 7 мМ в неинфицированных или инфицированных кольцевой стадии эритроцитах до ~4 мМ в клетках со средневозрастными трофозоитами и 2–3 мМ в шизонтосодержащих клетках независимо от объема ИРБК (рис. 1Б).

Гашение кальцеина с помощью FRET

FRET — это безызлучательный перенос энергии от донорного флуорофора к акцепторному хромофору [13] (см. дополнительный текст S1). Эффективность передачи энергии зависит от величины, обратной шестой степени межмолекулярного расстояния.На так называемом расстоянии Ферстера (R 0 , см. рис. 2А) энергия, передаваемая от донора к акцептору, составляет 50%. Расстояние Фёрстера зависит от спектральных свойств донора и акцептора (рис. 2В) и оценивается в ∼4,1 нм для пары кальцеин-гем. Интересно, что при физиологических концентрациях гема (∼28 мМ; 1 молекула Hb = 4 фрагмента гема) всегда существует значительная вероятность наличия акцепторов в непосредственной близости (∼R 0 ) от донора. Критическая концентрация гемоглобина ([Hb] 0 ), т.е.т.е., концентрация, при которой передается 76% энергии [13], таким образом, может быть оценена примерно в 1,7 мМ (см. Дополнительный текст S1). FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорного флуорофора пропорционально эффективности FRET (рис. 2, C), поэтому можно ожидать, что FRET, индуцированный молекулярным краудингом [14], может быть использован для картирования [Hb] в живых клетках. Эта гипотеза была первоначально проверена in vitro .

Рис. 2. Время жизни флуоресценции и FRET.

A) Кривая, показывающая сильную зависимость эффективности переноса энергии от относительного расстояния между донорными и акцепторными флуорофорами.B) Спектральное перекрытие между спектром излучения донора и спектром поглощения акцепторного флуорофора, такого как кальцеин и гем, от которых зависит FRET ( абс. , поглощение; а.е. , произвольные единицы). C) Прогнозируемое затухание флуоресценции флуорофора, такого как кальцеин, в присутствии 0% ( сплошная линия ), 50% и 80% ( пунктирные линии ) эффективности FRET.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003780.g002

Рис.3 представлены флуоресцентные изображения лизатов эритроцитов в присутствии кальцеина (100 мкМ) и их представление в виде векторных графиков [15]. Разведения лизата давали концентрации Hb от 0 до 6 мМ. Средние времена жизни флуоресценции показаны на рис. 4А: время жизни флуоресценции кальцеина в отсутствие гемоглобина составляло 4080 ± 10 пс, и [Hb]-зависимое тушение кальцеина, по-видимому, соответствовало предложенной модели (уравнение S2).

Рис. 3. Тушение кальцеина гемоглобином.

A) Изображения показывают уменьшение времени жизни флуоресценции кальцеина (100 мкМ) при концентрации гемоглобина (0–6 мМ) в лизатах эритроцитов.Время жизни флуоресценции легко различимо в диапазоне 0–4 мМ [Hb]. B) Те же данные калибровки представлены в векторном пространстве. Центроиды векторных распределений также показаны на рисунке 8 (кружки). отн. частота: относительная частота.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003780.g003

Рис. 4. Гашение кальцеина при различных концентрациях кальцеина и гемоглобина.

A) Среднее время жизни флуоресценции по сравнению с [Hb] (среднее из трех экспериментов).Экспериментальные значения соответствовали уравнению S6. B) Hb-зависимое тушение кальцеина при различных концентрациях кальцеина (50, 100 и 150 мкМ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003780.g004

Известно, что кальцеин проявляет самотушение при высоких (миллимолярных) концентрациях [16], а также предполагалось, что самотушение может происходить при концентрации до 3 мкМ [17]. Самогашение может привести либо к уменьшению, либо к увеличению времени жизни флуоресценции и может стать серьезным препятствием для измерения [Hb].Поэтому было важно проверить возможные эффекты самогашения в диапазоне концентраций кальцеина, предназначенных для измерений интактных клеток (<150 мкМ). Испытания in vitro показали, что максимальное изменение времени жизни флуоресценции кальцеина в диапазоне концентраций 10–500 мкМ составляло ~70 пс (данные не показаны) в фосфатно-солевом буфере, питательной среде и растворе A . На рис. 4В показано, что при уменьшении концентрации кальцеина (150 мкМ, 100 мкМ и 50 мкМ) значительного снижения активности кальцеина не происходило.Следовательно, кальцеин можно использовать для количественного определения концентрации гемоглобина в цитозольном домене инфицированных эритроцитов.

Калибровочные данные, показанные на рис. 3, затем соответствовали уравнению. 1 для отображения оценочных значений [Hb]. На рис. 5 показано соотношение между расчетным и измеренным [Hb]. Наклон сделал [Hb] 0 равным 1,70 ± 0,02 мМ, значение хорошо согласуется с предсказанным.

Рисунок 5. Измерение [Hb] 0 .

[Hb], оценено по ур.1, представлена ​​как функция измеренного [Hb] (пересечение равно нулю). Параметр [Hb] 0 был оценен по наклону линейной подгонки, как объяснено в тексте. Столбцы представляют собой стандартное отклонение результатов измерений, выполненных в трех повторностях.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003780.g005

Полученные результаты подтверждают, что основным механизмом тушения флуоресценции кальцеина, загруженного в эритроциты, является динамическое тушение, опосредованное FRET через нефлуоресцентный гем-хромофор.Таким образом, использование FRET, индуцированного молекулярной скученностью гемоглобина, может применяться для определения [Hb]. Отсутствие специфичности этого механизма может объяснить тушение, наблюдаемое с другими флуорофорами, излучающими ниже 600 нм, такими как Fura-2, Indo-1 и Fluo-4 [18], [19].

Прижизненная визуализация нормальных неинфицированных эритроцитов

На рис. 6 показано изображение эритроцитов с малым увеличением, полученное с помощью TCSPC. Высокая физиологическая концентрация гемоглобина делает метод умеренно чувствительным к изменениям [Hb] вблизи физиологических условий.Нормальные эритроциты (рис. 6A-B) показали среднее время затухания флуоресценции (среднее ± стандартное отклонение) 250 ± 20 пс (N  =  37), что соответствует [Hb] 6,3 ​​± 0,3 мМ. Когда эритроциты были набухшими в растворах с более низкой относительной тоничностью (RT), были четко обнаружены изменения времени жизни флуоресценции (рис. 6C). При ВУ 0,8 и 0,6 время жизни флуоресценции кальцеина увеличивалось до 280±20 пс (N = 38) и 380±40 пс (N = 30) соответственно, что эквивалентно концентрациям гемоглобина 5,9±0,3 мМ и 4,8±0,3 мМ. . При более низких значениях ВУ значительный лизис мешал оценке [Hb] и не мог быть отслежен.

Рис. 6. Визуализация времени жизни флуоресценции эритроцитов, нагруженных кальцеином.

A ) Флуоресцентное излучение (520–570 нм). B ) Время жизни флуоресценции кальцеина, показывающее снижение примерно с 4 нс при нуле [Hb] до 250 пс в интактных неинфицированных эритроцитах. Обратите внимание на изменение интенсивности флуоресценции и времени жизни флуоресценции среди клеток. Они отражают нормальное распределение инкорпорированного кальцеина и [Hb] в эритроцитах [19], [41]. C) [Hb], измеренный по времени жизни флуоресценции в эритроцитах, [Hb] которых был снижен путем уравновешивания в гипотонической среде (RT: относительный тонус).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003780.g006

Прижизненная визуализация паразитированных эритроцитов

На рис. 7 представлены репрезентативные изображения инфицированных и неинфицированных эритроцитов. Неинфицированные клетки показали однородную интенсивность флуоресценции и время жизни флуоресценции. Среднее время жизни флуоресценции кальцеина по неинфицированным клеткам в этих эритроцитах составило 250 ± 12 пс (рис. 7 Б, справа) и 250 ± 10 пс (рис. 7 Г, справа). В цитоплазме IRBC время жизни флуоресценции кальцеина колебалось от 290±20 пс для кольцевых IRBC (рис.7 Б, слева) до 590 ± 13 пс (рис. 7 Г, слева) и 1050 ± 60 пс (рис. 5 Е) для молодого и позднего трофозоита/раннего шизонта соответственно.

Рис. 7. Прижизненные изображения инфицированных эритроцитов.

На панелях A, C и E показаны изображения интенсивности флуоресценции неинфицированных эритроцитов ( A и C , справа ), кольцевой стадии ( A , слева ), молодого трофозоита ( C 4, левый ) и зрелый трофозоит/ранний шизонт ( E ).Стрелки на панелях C и E указывают на появление яркого края в IRBC. Соответствующие изображения времени жизни флуоресценции ( B , D и F ) показывают значительное увеличение времени жизни флуоресценции в цитозоле хозяина инфицированных клеток по сравнению с таковым в неинфицированных эритроцитах, что отражает снижение концентрации гемоглобина.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003780.g007

Чтобы различить области эритроцита, где находится паразит, и оставшуюся цитоплазму, изображения при жизни были сопоставлены с векторным пространством, что привело к AB -графики (рис. 8), где пиксели с одинаковым временем жизни группируются вместе [15], [20], [21].Эти кластеры могут быть выбраны, а соответствующие области сегментированы. Неинфицированные эритроциты всегда демонстрировали одиночные кластеры (рис. 8А) с редкими хвостами, которые сходились к фону флуоресценции (данные не показаны). Все инфицированные клетки демонстрировали два или три кластера, один из которых с меньшим временем жизни соответствовал цитоплазме эритроцитов. На фиг.8В показан IRBC, содержащий паразита кольцевой стадии; здесь кластер, связанный с паразитами (ii), менее определен (обратите внимание на другой масштаб) из-за небольшой области, занимаемой кольцом по сравнению с цитоплазмой эритроцитов (i).IRBC, содержащие ранние трофозоиты (рис. 8C) и поздние трофозоиты/ранние шизонты (рис. 8C-D), обычно демонстрируют три кластера, соответствующие (i) цитоплазме эритроцитов, (ii) паразиту и (iii) двум другим областям внутри IRBC, один сразу же окружает паразита, а другой образует периферическую зону под плазматической мембраной IRBC. Поздние трофозоиты/ранние шизонты (рис. 8D) часто обнаруживают только две области со сравнительно низкими оценками [Hb]. Цитозольный кластер с самым высоким [Hb] в каждой клетке использовали для оценки цитозольного [Hb].

Рис. 8. Сегментация изображений времени жизни по графикам AB (фазора).

AB-участки и соответствующие сегментированные области ячеек показаны на рис. 5. Сегментированные области показаны на ячейках зеленым, красным и синим цветами справа. A) Неинфицированные эритроциты (рис. 5 B справа). B) Ring-IRBC (рис. 5 B слева). C) Молодой трофозоит-IRBC (рис. 5 D слева). D) Зрелый трофозоит-/ранний шизонт-IRBC (рис. 5 E). Центроиды распределений векторов из данных калибровки (рис. 3) обозначены маленькими черными кружками, расположенными по часовой стрелке вдоль дуги от 0 мМ до 6 мМ.На графиках AB цветными кружками показаны три сегментированные области: i) цитозоль эритроцитов (красный), ii) малярийный паразит (зеленый) и iii) преимущественно периферический компартмент (синий) внутри трофозоитов/шизонтов: см. текст. отн. частота: относительная частота.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003780.g008

Концентрация гемоглобина в зараженных клетках

Среднее время жизни флуоресценции незараженных когорт составило 270±30 пс (N = 43), а ИРБК с паразитами кольцевой стадии — 267±13 пс (N = 10).Статистической разницы между этими двумя группами не было. Распределение времен жизни флуоресценции и соответствующих [Hb] было значительно шире в трофозоитах/шизонтсодержащих IRBC (550±230 пс, N = 30). На рис. 9 показана кумулятивная статистика оценок цитозольного [Hb]. Неинфицированные эритроциты и кольцевидные ИРБК демонстрировали статистически сходные концентрации гемоглобина 7,5 ± 0,4 мМ (N = 43) и 7,3±0,3 мМ (N = 10) соответственно. В обоих случаях доля погашенного кальцеина была близка к 1 (эритроциты: 1.00±0,01; кольца: 0,99±0,01), т. е. все молекулы кальцеина подвергаются переносу энергии. Эритроциты, содержащие паразитов посткольцевой стадии, были разделены на два класса: молодые трофозоиты (Т1) и зрелые трофозоиты/ранние шизонты (Т2). Без конкретных маркеров стадии и жизнеспособности невозможно приписать более точную стадию развития и состояние жизнеспособности индивидуально выбранным IRBC при конфокальном наблюдении. Визуальный осмотр образца позволяет классифицировать IRBC в соответствии с их морфологией или наличием агрегатов гемозоина.Отнесение трофозоитов к шизонтам на основании флуоресцентных размерных очертаний (рис. 7) и степени агрегации пигмента можно считать лишь грубым приближением. Несмотря на эту неопределенность, результаты на рис. 9А однозначно демонстрируют снижение концентрации Hb в цитозоле IRBC с паразитами на зрелой стадии. Во фракциях Т1 и Т2 концентрации гемоглобина в цитоплазме клетки-хозяина составляли 5,4±0,9 мМ (N = 16) и 4,9±1,1 мМ (N = 15) соответственно, при объединенном среднем значении 5.1±1,1 мМ (N = 31; T (все)). Разброс значений [Hb] был намного шире у инфицированных трофозоитами, чем у неинфицированных эритроцитов, в пределах от 2,1 до 7,1 мМ (рис. 9А, Т (все)). Фракция погашенного кальцеина (рис. 9В) составляла 0,77±0,07 (Т1), 0,71±0,07 (Т2) и 0,74±0,07 (Т (все)), что свидетельствует об умеренной компартментализации кальцеина; около 25% молекул кальцеина в цитозоле эритроцитов, инфицированных торофозоитами, не были обнаружены в непосредственной близости от фрагментов гема, несмотря на все еще обнаруживаемый высокий [Hb]. Две трети эритроцитов, инфицированных трофозоитами (T1), показали третий кластер, но только 20% клеток во фракции T2 показали три отчетливых кластера в векторном пространстве.Анализ значений из третьего кластера показал несколько более низкие значения [Hb] (4,3 ± 1,1, N   =   13), охватывающие диапазон от 1,7 до 5,8 мМ, и значительно более высокую компартментализацию (0,61 ± 0,09). Компартмент паразита показал кажущееся значение [Hb] 3 ± 1 мМ и долю погашенного кальцеина 0,46 ± 0,08. Эти значения, конечно, относятся к выборке, которая включала цитозоль IRBC ниже и выше паразита, а также сам паразит.

Рисунок 9. Статистический анализ цитозольной [Hb] (A) и фракций погашенного кальцеина (B).

В столбцах представлены неинфицированные когорты ( RBC ), IRBC, содержащие паразитов на кольцевой стадии ( кольцевая ), паразиты на стадии трофозоита ( T1 ) и паразиты на стадии трофозоита-шизонта ( T2 +2) и объединенные данные ( T все ). Значения, показанные на статистических диаграммах, были измерены в цитоплазме хозяина в результате сегментации с помощью вектора.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003780.g009

Обсуждение

Представленные здесь эксперименты были разработаны для проверки критического предсказания коллоидно-осмотической гипотезы (рис.1А), что развитие паразита сопровождается прогрессирующим снижением концентрации гемоглобина в цитоплазме клетки-хозяина [4], [7]. Обсудим сначала некоторые аспекты методологического подхода, примененного в данном исследовании. Как подчеркивалось во введении, оптимальным способом проверки этой гипотезы является картирование локальной концентрации гемоглобина в цитоплазме интактных, живых, инфицированных эритроцитов. Метод, разработанный и примененный для таких измерений, был основан на тушении флуоресценции включенного в клетку флуорофора кальцеина.Обе калибровки in vitro (лизат) и in situ (интактные эритроциты) с использованием флуорофора кальцеина (рис. 3 и 4) доказали, что время жизни флуоресценции чувствительно к локальной концентрации гемоглобина. Наблюдаемое сокращение времени жизни флуоресценции доказало, что FRET, вызванный скоплением молекул, действительно является основной причиной тушения и что его можно применять для оценки локального [Hb].

Конфокальное обнаружение вместе с TCSPC обеспечило пространственное разрешение, необходимое для количественного картирования [Hb] в цитозоле клетки-хозяина.Однако ограниченное количество фотонов на пиксель (~300), которые можно было собрать за 60 с времени сбора данных, сделало объединение изображений (5×5 пикселей, см. рис. 7) необходимым для достижения высокого отношения сигнал/шум, необходимого для подходят многопараметрические кривые подбора (уравнение S2 и уравнение S6 [22]). Эта стандартная обработка изображений размывает структуры в образце и снижает контрастность цитозоля инфицированных эритроцитов. Анализ среднего времени жизни флуоресценции (уравнение S6) показал значительное снижение [Hb] (данные не показаны), но не обеспечил необходимого пространственного разрешения.Поэтому мы использовали недавний метод представления данных о продолжительности жизни на основе AB-графиков (или векторов), которые отображают затухание флуоресценции с временным разрешением в линейное двумерное пространство, где траектории кластеров могут быть интерпретированы [15], [20]. Графики AB особенно полезны для сегментации данных о времени жизни флуоресценции [21], поскольку области образца с одинаковым временем жизни флуоресценции будут сгруппированы вместе в векторном пространстве.

Результаты показали, что [Hb] в цитозоле паразитированных клеток-хозяев уменьшилось со значений около 7.5 мМ в эритроцитах, используемых для культур, до значений от 2,1 до 7,1 мМ в IRBC, что находится в пределах диапазона, предсказанного численной моделью (рис. 1А). Такой подход позволил нам представить более детальное представление о молекулярных процессах, происходящих в живом IRBC. На самом деле, одним из наиболее важных преимуществ этого представления является возможность сегментации областей образца, которые демонстрируют различное время жизни флуоресценции до какой-либо подгонки данных [21]. Благодаря этой стратегии стало возможным четко различать паразита и цитоплазму эритроцитов.Фотоны, собранные из сегментированных областей (10 5 –10 8 ), обеспечили отношения сигнал/шум, необходимые для соответствия предлагаемой физической модели (уравнение 1) и для демонстрации снижения цитозольного [Hb]. Настоящие результаты, документирующие прогрессирующее разведение [Hb] по мере созревания паразита, подчеркивают важность изучения живых необработанных образцов клеток при оценке гомеостатических параметров. После подачи нашей рукописи появилась статья Парка и его коллег [23], документирующая общее снижение концентрации гемоглобина хозяина с созреванием паразита, подобное описанному здесь, с применением комбинации томографической фазовой микроскопии и дифракционной фазовой микроскопии.Таким образом, основное предсказание коллоидосмотической гипотезы подтверждается двумя независимыми наблюдениями, полученными разными методами, оба на образцах живых клеток.

Неожиданным открытием векторного анализа было наличие компонента с отличительными свойствами в IRBC со зрелыми паразитами. Краевые эффекты, вызванные артефактами движения эритроцитов, могут быть исключены, поскольку здоровые эритроциты демонстрируют, в худшем случае, очень узкую границу, определяемую немного отличающимся временем жизни, что можно объяснить смешиванием времени жизни кальцеина с фоновыми фотонами, что приводит к слабым хвостам в фазе вектора. (Рисунок.8). Отчетливое появление трех кластеров на векторных диаграммах трофозоитов-IRBC (см. рис. 8C) предполагает образование микродоменов в цитоплазматической среде клетки-хозяина, в которой гемоглобин, по-видимому, в значительной степени исключен из тесного контакта с кальцеином. У молодых трофозоитов эти домены видны в основном как обширная периферическая зона под плазматической мембраной IRBC с аналогичной, хотя и более узкой зоной вокруг паразита. В более зрелых ИРБК, где размер паразита больше, две области сливаются без промежуточной зоны, богатой гемоглобином (рис.8 Д). Это изменение сопровождается повышенной компартментализацией, измеренной для кальцеина.

Эти изменения, вероятно, отражают локальные изменения, вызванные паразитом в IRBC (см. рис. 10), включая экспорт и сборку молекул, предназначенных для образования щелей Маурера, бугорков и других структур паразитарного происхождения в периферической зоне клетки-хозяина. [24]–[27]. Отметим, что также интенсивность флуоресценции кальцеина выше на периферии клеток трофозоитов, содержащих ИРБК (стрелки на рис.7C и E), но не в неинфицированных эритроцитах (рис. 7A и C, справа) или IRBC на стадии кольца (рис. 7A, слева), что подтверждает интерпретацию значительного дегашения кальцеина под поверхностью мембраны. Точно так же на этой стадии интенсивен трафик паразитофорных вакуолей, окружающих трофозоит [28], и это может быть связано с измененной областью, близкой к поверхности паразита. Параметры модели, из которых была выведена коллоидосмотическая гипотеза, обеспечивают поддержание или быстрое восстановление осмотического равновесия между цитоплазмой клетки-хозяина и внеклеточной средой.Может ли Hb-рестриктированный микродомен под мембраной клетки-хозяина вмешиваться в такое равновесие? Хорошо известно, что изотонический сорбит или аланин сохраняют свой литический потенциал IRBC с паразитами всех стадий за пределами кольцевой стадии, что указывает на то, что Hb-рестриктированный домен под мембраной не представляет собой ограничивающего барьера проницаемости для NPP-опосредованных или водных потоков. Следовательно, любые домены между объемным Hb-содержащим цитозолем клетки-хозяина и внешней средой не могут изменить способ, которым поддерживается или восстанавливается осмотическое равновесие между этими двумя компартментами.

Рисунок 10. Интерпретационная диаграмма, иллюстрирующая наблюдаемые эффекты [Hb] и компартментации в ходе развития паразита.

Прямоугольники представляют состояние цитозоля эритроцитов / ирцитов, определенное с помощью FRET, с горизонтальными красными, синими и зелеными полосами, как на рис. 8.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003780.g010

В заключение, настоящие результаты демонстрируют, что хорошо известное снижение содержания гемоглобина в инфицированных малярией эритроцитах сопровождается сопутствующим снижением концентрации гемоглобина, что обеспечивает сильная поддержка коллоидно-осмотической интерпретации избыточного потребления гемоглобина.Они также показывают наличие подмембранного компартмента, где гемоглобин частично исключен, локально разведен или и то, и другое. Молекулярная основа этого изменения требует более подробного анализа сложного взаимодействия паразит-клетка-хозяин.

Материалы и методы

Химикаты

Все химические вещества имели качество аналитического реагента. Calcein-AM был получен от Invitrogen Ltd., Пейсли, Великобритания. Плазмагель был из Беллона, Нейи-сюр-Сен, Франция. EGTA, Hepes, глюкоза, инозин, пируват, ДМСО, среда RPMI 1640, сульфат гентамицина, глутамин, свободный кальцеин, тритон X-100, бычий сывороточный альбумин (BSA) и все общие соли были получены от Sigma-Aldrich Company Ltd., Джиллингем, Великобритания. Человеческая кровь и сыворотка, используемые в культурах, были получены от Национальной службы крови (Великобритания).

Культуры

Два клона P. falciparum (ITO4 и A4BC6, любезно предоставленные B.C. Elford, Институт молекулярной медицины, Оксфорд, Великобритания) [29] культивировали отдельно в эритроцитах человека в атмосфере с низким содержанием кислорода стандартными методами [30]. Культуральной средой была среда RPMI 1640 с добавлением 40 мМ HEPES, 25 мг/л сульфата гентамицина, 10 мМ D-глюкозы, 2 мМ глутамина и 8.5% (об./об.) объединенной человеческой сыворотки. Развитие и размножение паразитов оценивали в культурах путем микроскопического исследования тонких мазков крови, окрашенных по Гимзе, как сообщалось ранее [31]. Зараженные эритроциты собирали из культур непосредственно перед экспериментом.

Решения

Раствор A содержал (в мМ): NaCl, 145; KCl, 3; Na-HEPES (рН 7,5 при 37°С), 10; MgCl 2 , 0,15. Раствор АЕ : как А плюс 0,1 мМ Na-EGTA. Раствор AIP : как A плюс 5 мМ инозина и 5 мМ пирувата.Кальцеин-АМ использовали в виде маточного раствора 0,7 мМ в ДМСО. Исходный раствор свободного кальцеина составлял 10 мМ в ДМСО.

Загрузка кальцеина

Образцы клеток из культур малярии однократно промывали в AIP , ресуспендировали при гематокрите 2% (Hct) в той же среде и инкубировали при 37°C в течение 20 минут с кальцеином-АМ в концентрации около 120 мкмоль на литр эритроцитов, при условии 100% включения свободного кальцеина в клетки. Инозин в среде использовали в качестве гликолитического субстрата, а пируват — для обхода гликолитического блока, генерируемого высвобождением формальдегида при распаде ацетоксиметилового эфира, который остается полностью удерживаемым клетками [32], [33].После инкубации клетки дважды промывали центрифугированием и ресуспендировали в AIP ; ∼4·10 6 клеток затем переносили в камеру со стеклянным дном, покрытым поли-L-лизином (№ 1.0, MatTek Corp., Ашленд, Массачусетс, США) и далее инкубировали при 37°C в течение 60 минут, чтобы позволить прилипание к покровному стеклу. Затем надосадочную жидкость заменяли свежим раствором AE с добавлением 1% БСА, и камеру переносили в предметный микроскоп для визуализации.

Приготовление лизата для калибровки [Hb]

Венозная кровь (5–10 мл) здоровых добровольцев была взята после письменного согласия в шприцы, содержащие ЭГТА.Клетки немедленно центрифугировали (1500 g, 10 мин) для отделения плазмы, дважды промывали центрифугированием (1500 g, 5 мин) и ресуспендировали в 10 объемах раствора AE для удаления слабо связанного с клетками Ca 2+ . [34] и еще дважды в растворе А для удаления ЭГТА из среды. После каждого центрифугирования удаляли супернатант и лейкоцитарную пленку. После промывок клетки упаковывали центрифугированием (11 000 g, 3 мин) и лизировали добавлением Triton X-100 (1% об./об.).Исходный [Hb] в лизате оценивали по оптическому поглощению при 415 нм в разбавленных образцах, что дает значение [Hb] для исходного неразбавленного лизата в диапазоне от 6,5 до 7,0 мМ. Подходящие концентрации гемоглобина для калибровки были получены путем разбавления концентрированного лизата раствором A . Свободный кальцеин добавляли к образцам гемоглобина из исходного раствора 10 мМ в ДМСО для получения указанных конечных концентраций кальцеина. Дальнейшие тесты надежности оценок [Hb] в интактных клетках были проведены на эритроцитах, нагруженных кальцеином, подвергавшихся воздействию гипотонической среды, чтобы варьировать их [Hb].Гипотонические среды готовили в прелитическом диапазоне от 0,6 до 1 относительного тонуса путем разбавления раствора А бидистиллированной водой.

Микроскопия

Флуоресцентная визуализирующая микроскопия жизни выполнялась с использованием конфокального микроскопа собственной разработки на основе конфокального микроскопа Olympus FluoView 300 (Olympus UK Ltd, Уотфорд, Великобритания) в сочетании с лазерным источником суперконтинуума (SC450, Fianium, Southampton, UK) [35]. SC450 выдает импульсы длительностью ~10 пс с частотой повторения 40 МГц, что подходит для TCSPC.Система была модернизирована фотоумножителем PMC-100-20 и платой SPC-830 для коррелированного по времени счета одиночных фотонов производства Becker & Hickl GmbH (Берлин, Германия). Кальцеин возбуждали при 485 нм, и флуоресценцию собирали в диапазоне 520–570 нм. Данные TCSPC были проанализированы с помощью программного обеспечения SPCImage (Becker & Hickl GmbH) с трехэкспоненциальным затуханием и светорассеянием, чтобы обеспечить среднее время жизни, показанное на рисунках 3A, 4, 6B и 7. Средние скорости счета не превышали 10 5 импульсов. в секунду, чтобы избежать наложения импульсов.Все изображения были получены при комнатной температуре с масляным иммерсионным объективом 60× и большим (300 мкм) точечным отверстием для сбора достаточного количества фотонов в течение 60-секундного времени сбора данных.

Анализ данных

Изображения флуоресценции были сегментированы в векторном пространстве путем выполнения синусоидального (А) и косинусного (В) преобразования данных TCSPC [15], [20]. Графики AB были созданы с помощью программного обеспечения собственной разработки, запрограммированного в Matlab (The MathWorks Inc., Нови, Мичиган, США). Фотоны из каждой сегментированной области были объединены в бины, и с помощью итеративной реконволюции было подобрано следующее уравнение [36]: (1)

Представляет собой распад кальцеина, начинающийся с t 0 , погашенный свободно диффундирующим гемоглобином в присутствии нетушеного донора (с продолжительностью жизни τ) и разброс (τ S  = 10 пс), свернутый с функцией отклика прибора (IRF) и при наличии фона ( b ). a , b , c и s — абсолютные амплитуды различных компонент. Наилучшее соответствие было найдено при минимизации функции стоимости, предложенной Авайей [37], чтобы минимизировать смещения, вызванные наличием ячеек данных с низким количеством счетчиков. Молекулярную долю охлажденного кальцеина ( f CA-Hb ) можно определить по следующему уравнению: (2)

Дополнительная информация о FRET, индуцированном скоплением молекул, и об анализе данных представлена ​​в дополнительном тексте S1 и в литературе [13], [14], [38]–[40].

Численные вычисления

Радиус Фёрстера хромофоров кальцеин-гема был рассчитан путем численного интегрирования спектра флуоресценции кальцеина и скорректированного спектра поглощения оксигемоглобина, полученных Invitrogen Ltd (http://probes.invitrogen.com) и Oregon Medical Laser. Центр (http://omlc.ogi.edu) соответственно; численное интегрирование проводилось с помощью Mathematica (Wolfram Research Europe Ltd., Long Hanborough, UK; см. http://laser.cheng.cam.ac.uk). Прогнозы модели для гомеостаза IRBC были выполнены с помощью вычислительного кода программного обеспечения IRCM [4], [7], интегрированного в приложение, разработанное в Matlab для моделирования неоднородности значений параметров (см. http://www.pdn.cam. ac.uk/groups/lewlab за программное обеспечение; Мауриц, Эспозито, Гинзбург, Камински, Тифферт и Лью, неопубликованная работа).

Благодарности

Мы благодарны доктору Джереми Скепперу за полезные обсуждения и содержательные комментарии.

Авторские взносы

Задумал и спроектировал эксперименты: АЭ ТТ ВЛЛ. Выполнены опыты: АЭ ТТ. Проанализированы данные: А.Е. Написал статью: А.Е. ВЛЛ. Выполнено численное моделирование: AE JMM VLL. Предоставленные материалы, инструменты анализа и текстовое редактирование: TT JMM SS LHB CK.

Каталожные номера

  1. 1. Snow RW, Guerra CA, Noor AM, Myint HY, Hay SI (2005)Глобальное распространение клинических эпизодов малярии Plasmodium falciparum. Природа 434: 214–217.
  2. 2. Гинзбург Х., Кругляк М., Эйдельман О., Кабантчик З.И. (1983) Новые пути проницаемости, индуцированные в мембранах эритроцитов, инфицированных Plasmodium falciparum. Мол Биохим Паразитол 8: 177–190.
  3. 3. Кирк К. (2001)Мембранный транспорт в инфицированных малярией эритроцитах. Physiol Rev 81: 495–537.
  4. 4. Лью В.Л., Тифферт Т., Гинзбург Х. (2003)Избыточное переваривание гемоглобина и осмотическая стабильность эритроцитов, инфицированных Plasmodium falciparum.Кровь 101: 4189–4194.
  5. 5. Фрэнсис С.Е., Салливан Д.Дж., Голдберг Д.Е. (1997)Метаболизм гемоглобина у малярийного паразита Plasmodium falciparum. Ежегодный обзор микробиологии 51: 97–123.
  6. 6. Krugliak M, Zhang J, Ginsburg H (2002)Intraerythrocytic Plasmodium falciparum использует только часть аминокислот, полученных в результате переваривания цитозоля клетки-хозяина, для биосинтеза ее белков. Молекулярная и биохимическая паразитология 119: 249–256.
  7. 7. Лью В.Л., Макдональд Л., Гинзбург Х., Кругляк М., Тифферт Т. (2004) Избыточное переваривание гемоглобина малярийными паразитами: стратегия предотвращения преждевременного лизиса клеток-хозяев. Клетки крови, молекулы и болезни 32: 353–359.
  8. 8. Хорекер Б.Л. (1943) Спектры поглощения гемоглобина и его производных в видимой и ближней инфракрасной областях. Журнал биологической химии 148: 173–183.
  9. 9. Беккер В., Бергманн А., Хинк М.А., Кониг К., Бенндорф К. и соавт.(2004) Визуализация времени жизни флуоресценции с помощью коррелированного по времени подсчета одиночных фотонов. Исследования и техника микроскопии 63: 58–66.
  10. 10. Пелет С., Превите М.Дж., Со П.Т. (2006) Сравнение количественной оценки точности измерения переноса энергии в резонансе Форстера на основе визуализации интенсивности, спектра и времени жизни. Журнал биомедицинской оптики 11: 34017.
  11. 11. Эспозито А., Воутерс Ф.С., Бонифачино Дж.С., Дассо М., Харфорд Дж.Б. и др. (2004) Флуоресцентная визуализирующая микроскопия.Текущие протоколы в клеточной биологии.
  12. 12. Стейнс Х.М., Эллори Дж.К., Кирк К. (2001)Нарушение баланса насос-утечка для Na(+) и K(+) в инфицированных малярией эритроцитах. Американский журнал физиологии 280: C1576–1587.
  13. 13. Лакович Дж. Р. (1999) Принципы флуоресцентной спектроскопии. Нью-Йорк: Kluwer Academic/Plenum Publishers.
  14. 14. Förster T (1948) Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annalen der Physik 437: 55–75.
  15. 15. Дигман М., Кайолфа В.Р., Замаи М., Граттон Э. (2007)Фазорный подход к анализу изображений времени жизни флуоресценции. Биофизический журнал 94: L14–16.
  16. 16. Хаманн С., Киилгаард Дж. Ф., Литман Т., Альварес-Лифманс Ф. Дж., Винтер Б. Р. и др. (2002) Измерение изменений объема клеток путем самогашения флуоресценции. Журнал флуоресценции 12: 139–145.
  17. 17. Робертс К.Е., О’Киф А.К., Ллойд С.Дж., Кларк Д.Дж. (2003) Селективное подавление фотообесцвечивания увеличивает видимость флуоресцентного зонда.Журнал флуоресценции 13: 513–517.
  18. 18. Кестнер Л., Табеллион В., Вайс Э., Бернхардт И., Липп П. (2006) Кальций-визуализация отдельных эритроцитов: проблемы и подходы. Клеточный кальций 39: 13–19.
  19. 19. Лью В.Л., Эцион З., Букчин Р.М., Дакоста Р., Ваананен Х. и др. (1993) Распределение внутриклеточного хелатора кальция (Fura-2) в популяции интактных эритроцитов человека. Biochimica Et Biophysica Acta 1148: 152–156.
  20. 20. Clayton AH, Hanley QS, Verveer PJ (2004)Графическое представление и многокомпонентный анализ данных одночастотной флуоресцентной микроскопии.Журнал микроскопии 213: 1–5.
  21. 21. Wouters FS, Esposito A (2008)Количественный анализ визуализации времени жизни флуоресценции стал проще. Журнал HFSP 2: 7.
  22. 22. Эспозито А., Герритсен Х.К., Воутерс Ф.С., Реш-Генгер У. (2007)Микроскопия флуоресцентной визуализации: оценка качества и стандарты. В: Wolfbeis OS, редактор. Стандартизация флуорометрии: современное состояние и будущие задачи. Берлин Гейдельберг Нью-Йорк: Springer.
  23. 23.Парк Ю., Диез-Сильва М., Попеску Г., Ликотрафитис Г., Чой В. и др. (2008) Карты показателя преломления и динамика мембран эритроцитов человека, зараженных Plasmodium falciparum. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 13730–13735.
  24. 24. Фришкнехт Ф., Ланцер М. (2008) Расщелины Маурера Plasmodium falciparum в 3D. Мол Микробиол 67: 687–691.
  25. 25. Кук Б.М., Лингельбах К., Баннистер Л.Х., Тилли Л. (2004)Транспорт белка в эритроцитах, инфицированных Plasmodium falciparum.Тенденции Параситол 20: 581–589.
  26. 26. Hanssen E, Sougrat R, Frankland S, Deed S, Klonis N, et al. (2008) Электронная томография органелл расщелины Маурера эритроцитов, инфицированных Plasmodium falciparum, выявила новые структурные особенности. Мол микробиол 67: 703–718.
  27. 27. Przyborski JM (2008)Расщелины Маурера Plasmodium falciparum: индуцированные паразитами острова во внутриклеточном океане. Тенденции Паразитол 24: 285–288.
  28. 28. Тараски Т.Ф., О’Доннелл М., Мартинес С., Шнайдер Т., Трелка Д. и соавт.(2003)Создание транспортной системы эритроцитарных пузырьков малярийными паразитами Plasmodium falciparum. Кровь 102: 3420–3426.
  29. 29. Берендт А.Р., Симмонс Д.Л., Тэнси Дж., Ньюболд С.И., Марш К. (1989)Молекула межклеточной адгезии-1 представляет собой рецептор адгезии эндотелиальных клеток для Plasmodium falciparum. Природа 341: 57–59.
  30. 30. Trager W, Jensen JB (1976)Малярийные паразиты человека в непрерывной культуре. Наука 193: 673–675.
  31. 31. Тифферт Т., Стейнс Х.М., Эллори Дж.К., Лью В.Л. (2000)Функциональное состояние плазматической мембраны Ca2+ насоса в эритроцитах человека, инфицированных Plasmodium falciparum.Журнал физиологии 525 (часть 1): 125–134.
  32. 32. Тифферт Т., Гарсия-Санчо Дж., Лью В.Л. (1984)Необратимое истощение АТФ, вызванное низкими концентрациями формальдегида и сложных эфиров хелаторов кальция в интактных эритроцитах человека. Biochimica et biophysica acta 773: 143–156.
  33. 33. Garcia-Sancho J (1985) Пируват предотвращает истощение АТФ, вызванное формальдегидом или сложными эфирами кальция в эритроцитах человека. Biochimica et biophysica acta 813: 148–150.
  34. 34. Harrison DG, Long C (1968)Содержание кальция в эритроцитах человека. J Physiol 199: 367–381.
  35. 35. Фрэнк Дж. Х., Элдер А. Д., Свартлинг Дж., Венкитарман А. Р., Джейасехаран А. Д. и др. (2007)Конфокальный микроскоп белого света для получения многомерных изображений со спектральным разрешением. Журнал микроскопии.
  36. 36. Барбер П.Р., Амир-Бег С.М., Гилби Дж.Д., Эденс Р.Дж., Эзике И. и др. (2005)Глобальный и пиксельный кинетический анализ данных для обнаружения FRET с помощью многофотонного FLIM во временной области.Сан-Хосе, Калифорния, США: SPIE. стр. 171–181.
  37. 37. Awaya T (1979) Новый метод подбора кривой к данным с низкой статистикой без использования метода Chi-2. Ядерные приборы и методы 165: 317–323.
  38. 38. Бегетто С., Ренкен С., Эрикссон О., Джори Г., Бернарди П. и др. (2000) Значение генерации активных форм кислорода фотоактивированным кальцеином для митохондриальных исследований. Европейский журнал биохимии / FEBS 267: 5585–5592.
  39. 39.Wouters FS, Verveer PJ, Bastiaens PI (2001)Визуализация биохимии внутри клеток. Тенденции в клеточной биологии 11: 203–211.
  40. 40. Беннет Р.Г. (1964) Безызлучательный межмолекулярный перенос энергии. I. Синглет -> Синглетный перенос. Журнал химической физики 41: 3037–3040.
  41. 41. Лью В.Л., Рафтос Дж.Е., Соретт М., Букчин Р.М., Мохандас Н. (1995) Генерация нормального объема эритроцитов человека, содержания гемоглобина и распределения площади мембран путем «рождения» или регуляции? Кровь 86: 334–341.

застрял на трассе в Salford Priors | FRET

застрял на трассе в Salford Priors | ЛАД | Карлрекордс ••• показывай меньше

Каждую пятницу получайте свежие музыкальные рекомендации на свой почтовый ящик.

  • Цифровой трек

    Потоковое + Скачать

    Включает неограниченную потоковую передачу через бесплатное приложение Bandcamp, а также высококачественную загрузку в форматах MP3, FLAC и других форматах.

    Можно приобрести с подарочной картой

    Купить цифровой трек €1
    Отправить в подарок

  • Купить полный цифровой альбом
  • 180гр 2xLP вкл.скачать код

    Запись/винил + цифровой альбом

    Включает неограниченную потоковую передачу Over Depth через бесплатное приложение Bandcamp, а также высококачественную загрузку в форматах MP3, FLAC и других форматах.

    Продано

  • Полная цифровая дискография

    Получите все 72 релиза Karlrecords , доступные на Bandcamp, и сэкономьте 30% .

    Включает неограниченное потоковое вещание через бесплатное приложение Bandcamp, а также высококачественные загрузки Почему они говорят, что город похож на любой город?, Хибики Хана-Ма / Mycenae Alpha / Polytope de Cluny, Диаморфозы / Concret PH / Orient Occident / Bohor, .электроакустические работы, Taurhiphanie / Voyage Absolu Des Unari Vers Andromède / Gendy 3 / S.709, Видя прошлое, чем кажутся вещи, Фрагменты тоски, турецкий живот, и еще 64., а также , .

    Можно приобрести с подарочной картой

    Купить цифровую дискографию €317,80 (
    СКИДКА 30% )
    Отправить в подарок

кредитов

лицензия

все права защищены

тегов

Если вам нравится Over Depth, вам также могут понравиться:

.

Автор: alexxlab

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.