Сигнализации с обратной связью: Сигнализация с обратной связью

Содержание

Сигнализация с обратной связью: особенности сигнализации

Сигнализация с обратной связью на сегодняшний день считается лучшим решением для тех, кто хочет обезопасить свое транспортное средство от несанкционированного проникновения.

Сигнализация с обратной связью

Необходимо добавить, что двухканального типа сигналка либо с автосигнализация с обратной связью является целым комплексом технических деталей, полноценная работа которых дает возможность уберечь транспортные средства от несанкционированных проникновений, либо неправомерного влияния для того, чтобы нанести повреждение либо проникнуть внутрь транспортного средства. В основном комплект подобной сигнализационной системы основан из: сирены, датчика удара, специальных средств, куда отправляется оповещение о внешнем посягательстве, в основном тут выбирают брелок или GSM-модуль. Только из-за наличия данных элементом эта технология именуется как «обратная связь», так как любого типа действия, которые направлены на то, чтобы нарушить целостность транспортного средства – удар, проникновение для грабежа, сразу же можно зафиксировать и сообщить об этом с помощью того же брелка автовладельца.

Подобные сигнализационные системы с обратной связью, исходя из технической возможности, с помощью которых оснастила их во время производства компания-изготовитель, могут осуществлять различные задания. Некоторые, к примеру, могут всего лишь проинформировать о том, то открылась дверца, багажник либо капот, говорить о включении мотора либо ударах. А вот более функциональной, а значит дорогостоящие варианты популярных марок, кроме вышеперечисленной опции, к тому же способны осуществлять дистанционное включение двигателя либо узнавать автовладельца лишь с помощью самого брелка, который находится около нее, даже без потребности его применения.

Как работает автомобильная сигналка с обратной связью?

Работа сигнализационной системы с обратной связью осуществляется следующим образом: в транспортном средстве находится особый блок, способный принимать любой сигнал от пару датчиков, которые тоже являются частью всей охранной системы. При любом неправомерном воздействии на транспортное средство со стороны грабителя сразу начнет считываться с помощью датчиков и передастся в блок, откуда как сигнал информации поступит на брелок либо модуль автовладельца. Исходя из конструкции брелка, автовладелец увидит либо мерцание светодиода, что свидетельствует о несанкционированных проникновениях, либо на жидкокристаллических экранах можно оперативным образом выяснить о действительном состоянии транспортного средства и ее месторасположении. Кроме того, обратная связь в автосигнализации дает возможность осуществлять управление транспортным средством. Для пользователей оказывается доступным опции вроде автозапуска мотора, заблаговременный прогрев салона автомобиля, дистанционное управление багажником и иные функции, которые могут упростить жизнь автовладельцам.

Но в сигнализационной системе имеется явный минус, грабитель может перехватить сигнал и открыть транспортное средство либо  отключить автомобильную сигнализацию. Из-за этого основатели сигнализационной системы все еще занимаются разработками и внедрением новых форм защиты данной сигналки, сменяют частоту, пользуются GSM сигналом и используют разнообразные кодировки информации.

Основные типы автомобильной сигнализации

Условным образом автомобильные сигнализации бывают следующих трех видов — это односторонняя, двусторонняя и с применением спутниковой системы отправления оповещения. Первая разновидность считается устаревшей вследствие отсутствия канала, который бы оповещал  автовладельца при посягательстве на его автомобиль. Чтобы оповестить в них применяется звуковой и световой методы, а максимальной дальностью действия является около 200 м, при этом местность открытая.

Более совершенный вариант — это двусторонняя автомобильная сигнализация с обратной связью, которая оснащена ЖК-экраном на брелке. За исключением светового и звукового метода оповещений, эта разновидность передает информацию о том, что посягались на транспортное средство на брелок. Если имеется жидкокристаллический дисплей, на брелке могут отображаться действия, которые имеют место сейчас с транспортным средством.

Двустороннего типа автомобильная сигнализация в большинстве случаев оснащена особым датчиком, который реагирует на наклон транспортного средства  и датчик объема. Автомобильная сигнализация с обратной связью действует на расстоянии примерно 4 км.

Самый продвинутый вариант — это автомобильная сигнализация третьей разновидности. Их расстояние действия ограничивается лишь нахождением либо отсутствием спутниковой связи в конкретном участке, к тому же, сигнализация, которая оснащена спутниковой системой оповещений, в любой промежуток времени может отправить автовладельцу точную информацию о месторасположении его транспорта и её передвижения.

Функции автосигнализации

Благодаря двусторонней связи с транспортным средством обеспечивается связь на расстоянии до 2000 м — это связь имеет место между брелком и охранной автосигнализацией. В основном, это является максимальным расстоянием под открытом воздухом без какой-либо помехи. Если рядом находятся высотные сооружения, дальность ловли автосигнализации способна снизиться в два раза. В городах, где высокая зашумленность радиоэфира, самое высокое расстояние о том, что получили извещение на брелок о имеющем место с транспортным средством достигает приблизительно км.

Автозапуск — это включение мотора с брелка на транспортных средствах, у которых механический короб передачи и «автомат». Сразу же сказывается на цене, однако даю совет подбирать сигнализационную систему с этой возможностью. Довольно комфортна зимой, когда вы можете из квартиры включить двигатель, таким образом сократится промежуток времени прогрева холодного транспортного средства. Дате возможность выполнить установку автозапуска мотора на конкретный промежуток времени и обеспечивать в салоне автотранспорта оптимальный температурный режим.

Турботаймер является системой, которая при движении следит за оборотом мотора и запоминает их. Когда транспортное средство оказывается под охраной, продолжительность работы мотора основана из того, в каком процессе работала постоянно транспортное средство, пока не включили сигнализационную систему: езда на высоком обороте — контрольным временем может оказаться 6 мин, а при спокойном движении — хватает нескольких мин. Эта система может заработать после того, как поставили транспортное средство под охрану, то есть после того, как вынули ключ из замка зажигания, двигатель все еще работает определенный промежуток времени. Эта система незаменима для автовладельцев с турбонаддувом.

Программирование функции дает возможность применять новые функции, чтобы пользователям было удобно. К примеру, вы можете сделать настройки открытия багажника, при этом вам не придется открывать двери, осуществлять контроль за состоянием батареи от аккумулятора, температурного режима двигателя и атмосферы в салоне транспортного средства. Довольно удобная функция — это нахождение транспортного средства на стоянке либо функция автоматических закрываний дверных проемов, когда набирается определенная скорость.

Главными преимуществами сигнализации

Первый момент, на который необходимо посмотреть, когда выбираете автомобильную сигнализацию — расстояние действия и присутствие возможности автоматического включения. Не нужно требовать от сигналки транспортного средства очень многого — ее не должны использовать для противостоянию попытке грабежа, ее функция — в том, чтобы оповещать автовладельца о происходящем с транспортным средством. Если необходима сигналка, чтобы всего лишь открыть или закрыть дверцу — берем наиболее дешевый вариант. Самыми популярными считаются автомобильные сигнализации производства компаний Пандора, StarLine, Аллигатор и так далее.

Главными преимуществами сигнализации c обратной связью являются:

  1. удобство применения;
  2. свой контроль за машиной;
  3. низкая стоимость;
  4. качественная защитная система;
  5. вероятность монтажа в любые бренды транспортных средств.

У каждой системы имеется сертификат, свидетельствующий о его качестве и эффективно может справляться с перенесением сложного эксплуатационного условия. Эта разновидность сигнализационной системы окажется оптимальным решением, чтобы использовать ее во время продолжительной поездки либо применения транспортного средства зимой. Потребителям не составит особого труда выбрать необходимый вариант сигнализационной системы.

Важные моменты при выборе сигналки с обратной связью

Обычно во время приобретения охранной сигнализационной системы нужно принять во внимание кое-какие важные моменты: комфорт применения, эффективность сканирования, дальность влияния, польза защиты и время эксплуатации. К тому же на выборе сказывается бюджет автовладельца и его необходимости. Бывают владельцы транспортных средств, которые сразу же применяют пару разновидностей охранной системы, что дает возможность существенным образом увеличить безопасность транспортного средства.

Подпишитесь, чтобы не пропустить ничего важного

Автосигнализация (с автозапуском, обратной связью)

Словом «автосигнализация» принято обозначать специальное оборудование, которое звуковым или иным способом оповещает автовладельца или, окружающих машину, людей о том, что с ней происходят какие-либо неприятности. Сразу оговоримся, что следует различать между собой понятия противоугонных систем и противоугонных комплексов.

Среди противоугонных охранных систем различают: собственно автосигнализацию, иммобилайзер (электронная блокировка двигателя) и механические средства (устанавливаемые отдельно – замок на рулевой вал или КПП, замок капота и другие). Противоугонный комплекс — это подобранная комбинация из охранных систем, часто индивидуального технического наполнения.

Обычно сигнализация состоит из: основного блока, брелока, антенны приемо-передатчика, светодиодного индикатора, кнопки сервиса и датчика удара. Основной способ ценовой классификации самих автосигнализаций, представленных на рынке на сегодняшний день, базируется на технических особенностях связи автомобиля с устройством управления (брелоком). По этому принципу автомобильные сигнализации делятся на: имеющие одностороннюю связь и имеющие обратную (двустороннюю) связь.

Сигнализирующие охранные системы без обратной связи на сегодня являются самыми простыми и дешевыми. Их задача — не дать (случайному) вору завести автомобиль (за счет работы внутреннего электронного блока) и сообщить о несанкционированном проникновении в машину окружающим (без информирования владельца, если тот находится вне зоны видимости автомобиля и звуковой досягаемости сирены). К сожалению, таким способом легко можно отпугнуть только случайного взломщика или хулигана (что актуально для недорогих авто и автомобилей средней ценовой категории). Однако для профессионального автоугонщика проблема взломать такую сигнализацию особого труда не представляет. Поэтому можно говорить о том, что в настоящее время автосигнализации без обратной связи в плане реальной защиты автомобиля — это уже вчерашний день.

Автосигнализации с двусторонней (обратной) связью информируют владельца обо всем, что происходит с его машиной. Выполняется эта функция путем передачи на экран брелока данных о том, какому конкретно воздействию подвергся автомобиль, причем не обязательно этот момент будет сопровождаться звуковой сиреной. Современная двусторонняя связь может выполняться по трем алгоритмам: динамического и диалогового кодирования и путем передачи сигнала по мобильной связи (GSM-модуль). И тут начинается основная интрига, так как от способа кодировки напрямую зависят реальные противоугонные характеристики автосигнализации с обратной связью. Сегодня на рынке предлагаются самые различные модели автомобильных сигнализаций с обратной связью, разнообразие которых в основном базируется на комбинации прилагаемых тюнинговых функций, таких как запуск двигателя (автозапуск) в отсутствие водителя, управление электрическими стеклоподъемниками, регулировка настроек кондиционера, магнитолы, водительского сиденья и других. Итоговая цена такой автосигнализации зависит от уровня и количества встроенных опций. И зачастую информация о способе кодировки, используемой в обратной связи автосигнализации, не является ключевой для покупателя – а зря.

Поскольку наша задача — обзор возможностей современных автосигнализаций и их характеристик, вернемся к алгоритмам кодировки двусторонней связи. Динамическое кодирование основано на использовании запрограммированного алгоритма изменения кодов, по которым распознают друг друга блоки автосигнализации – находящиеся в автомобиле и в брелоке. Самым известным, доступным и распространенным среди способов динамической шифровки является KeeLoq (запатентован американской компанией Microchip Inc.). KeeLoq популярен среди производителей автосигнализаций благодаря своей недорогой лицензии (или возможностью пиратского использования), надежности, дешевым кодерам KeeLoq, из-за малых размеров отлично подходящих для конструирования брелока. Однако благодаря его распространенности этот код доступен всем, в том числе злоумышленникам, которые при помощи печально известных кодграбберов (устройство считывания и копирования кода) без серьезных усилий открывают автомобиль защищенный такой сигнализацией. Цена на автосигнализацию с обратной связью с динамическим кодированием без особых функциональных изысков и без учета установки колеблется в пределах 70-90 у.е.
Диалоговое кодирование опирается все на тот же код KeeLoq, но не применяет стандартных вариантов, а варьирует его самые сложные возможности с использованием статических и динамической части алгоритма. Такие автосигнализации появились на рынке недавно и пока еще представляют определенные трудности для профессиональных взломщиков авто, их базовая цена находится на уровне 200-250 у.е. Автосигнализаций с элементами диалогового кодирования обратной связи на рынке не так много, однако можно предположить, что именно за ними — ближайшее будущее.
Недостаток и первых и вторых типов автомобильных сигнализаций с обратной связью – реализация этой связи происходит только по средствам их радиопередатчиков – что значительно ограничивает радиус действия двусторонней связи (порядка полукилометра в пределах “прямой видимости”). Но этого недостатка лишена следующая реализация обратной связи…
Автосигнализация с GSM-модулем позволяет владельцу практически всегда и везде (где имеется мобильная связь) «видеть» свой автомобиль благодаря постоянному общению с ним через сеть мобильной связи. Понятно, что это самый современный, сложный и дорогой принцип, реализуемый в защите машины путем сигнализации на сегодня, он еще не получил большого распространения. Его «минусы»: во-первых, дороговизна при покупке, установке и абонентском обслуживании, во-вторых, связь с автомобилем будет утеряна, как только машина попадет в зону «вне доступа» либо будет применено оборудование, глушащее сигнал. Базовая автосигнализация со встроенным GSM-модулем обойдется покупателю в среднем в 400-700 у.е.

Среди автосигнализаций с односторонней связью из широко известных можно назвать Challenger, двусторонней с аналоговым кодированием в базовом варианте – Pharaon, Sheriff. Среди таких «модных» сегодня автосигнализаций с обратной связью премиум-класса, как ScherKhan, Tomahawk, Pandora, StarLine только две последние можно отнести к разряду диалоговой кодировки, причем у StarLine функция автоматического контроля канала обратной связи полноценно работает только первые десять минут. Львиную долю их стоимости составляют увеличенная дальность каналов управления и оповещения, автозапуск двигателя и другие сервисные функции.

Немного о процессе подключения автосигнализации… для установки автосигнализации необходимо произвести вмешательство в электронные «мозги» автомобиля для подключения проводов к автоэлектропроводке и периферийным участкам сигнализационного оборудования (к сирене, светодиодному индикатору, концевым выключателям, всевозможным датчикам). Соответственно, чем больше всякого разного периферического оборудования владелец хочет установить на свой автомобиль вместе с сигнализацией, тем больше его машина будет «раскурочена». Возвращение деталей салона и кузова на свои места после монтажа всех звеньев системы не всегда проходит гладко, оставляя после себя царапины, вмятины — в общем, портя внешний вид… Поэтому установку автосигнализации (а тем более с дополнительными функциями) лучше поручить сертифицированным профессионалам.
Стоит отметить, что подключение такой функции, как автоматический запуск двигателя (автозапуск) требует отключения иммобилайзера, что не может не отразиться на общей безопасности автомобиля (и даже порой влечет за собой повышение тарифа по КАСКО, а то и отказ в страховании).

Чтобы не переплатить за то, что в будущем вряд ли потребуется, при выборе охранной автомобильной сигнализации необходимо изучить и оценить ее функциональность. Если хозяин авто испытывает потребность только в функции отпугивания «шпаны», то вполне подойдет сигнализация без обратной связи. При определенных запросах к удобству можно остановить свой выбор на автосигнализации с динамической обратной связью (коих подавляющее большинство на рынке), при этом сфокусировав внимание на дополнительном функционале. Так, человеку рассеянному пригодится опция автоматического включения сигнализации, а в морозное время года любому водителю приятно сесть в заранее прогретый автомобиль (опция автозапуска двигателя в отсутствие хозяина). Как было сказано выше, автосигнализация может по совместительству управлять большим количеством функций салонного комфорта, но увеличение числа «наворотов» существенно поднимет цену оборудования.

Важно помнить, что установка автосигнализации не является панацеей от профессионального взлома. Хорошим дополнением охранных функций для автомобиля послужат иммобилайзер (в настоящее время он штатно устанавливается почти всеми производителями на новые авто), механические средства защиты и … элементарная осторожность и аккуратность в выборе места для парковки.

Сигнализации с обратной связью! в Москве по низким ценам!

Установка автосигнализации с обратной связью — В сертифицированных центрах AutoSab
с сохранением дилерской гарантии!!! 8 (495) 500–76–86
Низкие цены! Акции! Скидки!
Звоните!

              

Cигнализации с обратной связью

 

На данный момент наша компания осуществляет широкий спектр услуг по установке сигнализаций с обратной связью по привлекательным ценам в Москве.

Мы готовы предложить Вам первоклассный сервис, широкий выбор автомобильных сигнализаций от известных торговых марок, установку автомобильных сигнализаций с обратной связью в максимально быстрые сроки и по минимальной цене.

Следует отметить, что начиная установку автомобильной сигнализации  мы обращаем внимания на несколько немаловажных факторов:

 

• условия, в которых эксплуатируется Ваш автомобиль
• особенности самого автомобиля
• особенности применения той или иной сигнализации на Вашем авто

 

Сигнализация с обратной связью цены в Москве

Часто при разговоре о цене установки автомобильной сигнализации в Москве подразумевается сумма, равная примерно 5 % от стоимости автомобиля. Если говорить более подробно, то установка сигнализации на авто – это трудоемкий процесс, цена на который состоит из некоторых параметров:

 

• марка охранной системы.
• наличие дополнительных функций и модулей.
• сложность монтажа сигнализации на конкретный автомобиль.

 

Если Вы решили купить сигнализацию с обратной связью на свой автомобиль, всегда помните, что качество работы сигнализации будет зависеть напрямую от ее цены и от того, насколько квалифицированным специалистом она была установлена.

 

Поэтому устанавливать охранные системы следует только в организациях, которые на этом специализируются.

 

Следует отметить, что установка сигнализации занимает примерно от 4х до 6ти часов.

 

 

Самые популярные модели!

             

          

 

 

 

 

Наша фирма предлагает установку автосигнализаций в Москве любой сложности с 3х летней! гарантией на сигнализацию и с бессрочным  последующим постгарантийным обслуживанием.

 

Противоугонные системы, предлагаемые нашей компанией способны дать серьезный уровень защиты и комфорта, необходимый Вашему автомобилю. Большой выбор автосигнализации может удовлетворить потребности любого автовладельца. Начиная от простых автосигнализации с обратной связью и автозапуском, до самых современных криптоустойчивых систем (не подверженных взлому электронными способами — Кодграбберами). Хорошая сигнализация с обратной связью не может, стоить дешево.

 

Сигнализацию с обратной связью купить и установить, можно позвонив нашим менеджерам по тел. +7 (495) 500-76-86 или заказав обратный звонок!!!     

                    

Установка сигнализации на авто не должна быть единственной защитой, мы рекомендуем сделать дополнения механической защитой коробки передач или подкапотным замком, неплохо оборудовать авто противоугонными блокировками дополнительного иммобилайзера или поставить секретку.

 

Установка сигнализации с обратной связью

Автомобильная сигнализация – это система, призванная обеспечить сохранность автомобиля и предотвратить его несанкционированное использование или угон, вовремя оповестив владельца. Заводскими противоугонными системами оборудуется основная масса автомобилей уже более 10 лет. Без штатной охраны могут сходить с конвейера лишь авто самой бюджетной категории и в комплектациях проще некуда, которые для угонщиков просто не представляют интереса.

Принцип работы обычной штатной охранной системы – это включение блокировки двигателя при попытке его запуска, если не обнаружен чип-ключ. Также при открывании дверей без чип-ключа в зоне видимости включаются кратковременные сигналы клаксона и оповещение внешними световыми приборами. Зачем же нужна установка дополнительной сигнализации? И почему эта услуга так востребована на рынке дополнительного оборудования сегодня?

• Наличие современного оборудования позволяет угонщикам обойти штатную сигнализацию, подключившись к бортовой сети авто через стандартный диагностический разъем. Всего лишь каких-то десять лет назад это не представлялось возможным с такой легкостью, но прогресс не стоит на месте.

• Дополнительная автосигнализация имеет расширенный функционал в плане защиты авто от проникновения и угона.

• Обладает полезными сервисными функциями, повышающими качество и удобство эксплуатации автомобиля.

• Выпускаемые сегодня топовые модели автомобильных сигнализаций представляют собой целые комплексы по контролю за состоянием автомобиля и его местоположением, с возможностью дистанционного наблюдения и управления всеми имеющимися функциями. Это стало возможным благодаря средствам сотовой связи и системам глобального позиционирования. Расстояние до автомобиля теперь не имеет значения.

• Широкий ассортимент моделей и приемлемые цены на установку делают автомобильную сигнализацию вполне доступной для каждого автовладельца.

На сегодняшний день автосигнализации подразделяются на основные типы:

• По типу связи с владельцем – с обратной связью и с односторонней.
• По наличию функции дистанционного запуска двигателя и без нее.
• По наличию возможности управлять системой с телефона и вести полный мониторинг за автомобилем.

Ниже пойдет речь об автосигнализациях с обратной связью без функции автозапуска.

Автосигнализации с обратной связью – особенности

Основное отличие автосигнализаций с обратной связью – это наличие брелка с дисплеем, а также расширенных возможностей по охране и сервисным функциям. На дисплее в виде иконок отображается вся необходимая информация о статусе охранной системы и режимов. Управление командами осуществляется курсорным способом. Каждой иконке на экране соответствует свой режим или функция. Наличие обратной связи подразумевает отклик автомобиля на команду с брелка, либо оповещение владельца о нарушении какой-либо из зон охраны или активация сервисной функции.

На сегодняшний день автосигнализация с обратной связью – это минимальное требование для охранной системы современного авто. А если автомобиль достаточно дорогой и потенциально интересный для угонщиков, установка сигнализации с обратной связью становится обязательным условием для его сохранения у владельца. Только подобный охранный комплекс способен вовремя предупредить о попытках проникновения в авто или о нарушении какой-либо из его зон охраны. Особенно, если автомобиль находится за пределами зоны видимости и не всегда можно услышать звук сирены.

Функционал, технические особенности, охранные и сервисные функции

В автосигнализациях с обратной связью при передаче команд используется специальный код, предназначенный для защиты передаваемого сигнала от перехвата и расшифровки – тип шифрования. Самые бюджетные сигнализации используют шифрование по протоколу KeyLock. Это устаревшая технология, и для ее взлома давно придуманы код-грабберы. Поэтому по-настоящему надежные охранные комплексы снабжены более прогрессивным плавающим, или диалоговым кодом шифрования своих сигналов. Он изменяется при каждом запросе, и действует только один раз. Копировать его бесполезно, так как при следующем запросе шифр уже изменится на другой. На сегодняшний день не существует технологий, способных расшифровать код типа Dialog со стороны. Это гарантирует абсолютную безопасность сигнализации от электронного взлома.

На экране брелка обратной связи схематично изображен автомобиль и выделены зоны, которые контролирует система. Это так называемые зоны охраны — двери, капот, багажник (для контроля используются показания штатных или дополнительно установленных концевиков). При срабатывании концевика – на брелке подсвечивается соответствующая иконка, и владелец понимает, что открыт, например, капот. В комплект входит датчик удара, который регистрирует вибрации на кузове, и при превышении установленного порога чувствительности сигнализирует об этом. Многие из датчиков удара – двухуровневые, то есть регистрируют два вида сотрясений – более сильные и слабые. Датчики настраивается на приемлемую чувствительность под нужды владельца. Например, самая чувствительная настройка будет оповещать владельца даже о самых незначительных потрясениях кузова, например, от звука пролетающего самолета или проезжающего мимо грузовика. Датчики удара можно отключать с брелка.

Датчик объема — ультразвуковое устройство, реагирующее, как на проникновение в автомобиль, так и на приближение к нему, поэтому создает две зоны контроля: внутреннею и внешнею. Датчики объема бывают аналоговыми и цифровыми.

Датчик наклона-перемещения регистрирует изменения положения в пространстве по любой из осей, и будет бить тревогу даже при попытке поддомкрачивания авто, например с целью снять колеса.

Режим «антиограбление», или паника, активирует все охранные функции системы, включая блокировку двигателя, сирену, световые сигналы. Служит для привлечения внимания или для поиска авто на стоянке.

Все сработки, а также статус режима охраны (включен или выключен) отображаются на экране брелка. Помимо этого, индикация сопровождается звуковыми сигналами, в том числе при нарушении режимов или зон охраны.

Из наиболее полезных функций, которые сделают пользование автомобилем еще более удобным и комфортным, можно выделить следующие:

Поиск автомобиля и контроль его состояния

Чтобы проверить, все ли в порядке, достаточно нажать кнопку поиска автомобиля на брелке. Если он находится в пределах досягаемости, придет подтверждение с индикацией активных режимов и функций. Путем нажатия комбинаций кнопок, на брелок выводится информация о температуре в салоне, температуре двигателя, оставшемся заряде АКБ.

Режим автопостановки на охрану

Если случайно был выключен режим охраны, но в течение 30 секунд не открылась ни одна дверь, система автоматически включает его снова.

Сервисный режим Valet

Перевод системы в режим сервиса отключает охранные функции. Если необходимо предоставить авто, например, для сервисного обслуживания, и забрать с собой брелки. Также в этом режиме осуществляется программирование, включение или выключение всех встроенных функций сигнализации.

Режим бесшумной охраны

Есть возможность поставить на охрану автомобиль, когда при срабатывании сигнализации звуковое оповещение будет только на брелке, а сам автомобиль не будет подавать сигналы тревоги сиреной.

Вызов из автомобиля

Нажатие кнопки, расположенной на передатчике в салоне, отправляет сигнал вызова для владельца на брелок.

Режим турботаймера

Позволяет оставить двигатель работающим на несколько минут для автомобилей с турбиной, после того как владелец ушел и поставил систему на охрану.

Имеются и другие второстепенные функции, например:

• часы с будильником, блокировка кнопок и выключение динамика на брелке;
• канал для подключения дополнительных устройств и управлением ими с брелка;
• индикация оставшегося заряда батарейки брелка;
• индикация наличия связи с автомобилем;
• регулировка громкости сирены с брелка.

Дальность действия брелка обратной связи

Обратная связь возможна при наличии радиоконтакта брелка с модулем сигнализации, установленном в автомобиле. Поэтому значение имеет дальность действия передатчика брелка. Значения, заявляемые большинством производителей – до 2-х километров при прямой видимости. При наличии препятствий в виде зданий и прочих сооружений, металлических конструкций – дальность сокращается в разы. Также большое значение имеют источники мощных электромагнитных помех, которых в городе более чем достаточно. В связи с этим реальная дальность брелка бывает далека от обещаний производителя и напрямую зависит от окружающей обстановки.

Ассортимент автосигнализаций с обратной связью

На сегодняшний день на рынке автосигнализаций с обратной связью присутствуют следующие бренды. Наиболее бюджетные: CENMAX, KGB, Sher-Khan, а также множество аналогов китайского производства с различными названиями. Эти системы имеют неплохой функционал по сервисным функциям, мало уступающий более дорогим системам. Однако в плане надежной охраны не способны защитить авто, поскольку используемый в них код шифрования сигнала – устаревший (у некоторых моделей) и легко взламывается грабберами. Среди них встречаются откровенные подделки, которые часто сбоят в работе, самопроизвольно могут включать или выключать функции, что иногда бывает небезопасно (поэтому вряд ли стоит обращать на них внимание).

Наиболее популярные из брендов, использующих при разработке диалоговый код для своих систем:

Alligator – бренд известен на рынке автосигнализаций с момента их появления. Имеет в ассортименте солидный выбор моделей от самых простейших без обратной связи до полноценных современных систем. При производстве использует диалоговый код собственной разработки (BACS). Брелки обратной связи по результатам тестов показывают наилучшую дальность в городских условиях среди конкурентов.

Starline – самый распространенный и доступный бренд на рынке автосигнализаций, с наилучшим соотношением цена-качество. Прямой конкурент бренда Pandora, из его преимуществ, кроме меньшей цены за тот же функционал и надежность, можно отметить простоту в использовании и настройке режимов. Здесь не требуется спецоборудования, все настройки меняются в сервисном режиме VALET с помощью кнопок брелка. Разнообразие моделей перекроет нужды и требования любого покупателей. Выпускаемые системы имеют диалоговое шифрование и до 512 каналов для лучшей связи в условиях городских помех. Две линейки систем – с функцией автозапуска и без нее. Присутствует специально разработанный комплекс для установки на мототехнику, и 24-вольтовая система для установки на грузовые автомобили.

Установка сигнализации с обратной связью

С появлением автомобильных протоколов CAN и LIN больше нет необходимости протягивать километры проводов к дверям, капоту и так далее, чтобы обеспечить нормальное функционирование всех функций охранной системы. Все современные модели сигнализаций «заточены» под интеграцию в штатную электросеть авто. Для контроля зон охраны в полной мере задействуется и используется штатная проводка. Сегодня установка автосигнализации в современный автомобиль стала простой как никогда. Провода протягиваются только в случае необходимости, например, для подключения датчиков. При установке необходимо учесть наличие у автомобиля и охранной системы соответствующих протоколов и их поддержки.

Установка возможна как самостоятельно, при наличии соответствующего опыта, так и в установочном или дилерском центрах. Следует иметь в виду, что при работе со сложным электронным оборудованием и его настройкой возможны неожиданные затруднения. Это может быть связано со спецификой конкретного автомобиля или же с особенностями охранной системы.

Специалист-профессионал, имеющий опыт и необходимое оборудование, способен разрешить любую возникшую при монтаже сложность оптимальным образом. Именно поэтому, в деле установки автосигнализации, как и во многих других, важен профессиональный подход. Кроме того, если автомобиль находится на гарантии производителя, неквалифицированное вмешательство может повлечь в некоторых случаях снятие гарантийных обязательств. Обратившись к специалистам, вы получите гарантированное качество установки с учетом совместимости оборудования и беспроблемное дальнейшее использование автомобиля.

Установка сигнализаций с обратной связью с гарантией


Сертифицированное
оборудование
Гарантия на
оборудование и
установку
Сохранение
дилерской гарантии

Автомобильная сигнализация с обратной связью

В последние годы автосигнализации с обратной связью получили большую популярность на рынке охранных систем. Оно и понятно, учитывая удобство и комфорт в использовании данного решения.

В особенности автосигнализации с обратной связью удобны в случаях, если автомобиль находится на стоянке либо в гараже далеко от дома. Сирена, даже самая мощная, не может при этом своевременно проинформировать владельца о посягательстве на его собственность.

Кроме того, нередко охранные комплексы с мощными сиренами вызывают справедливый гнев соседей, поскольку имеют свойство срабатывать от самого различного сочетания факторов – от проехавшего мимо грузовика до кошки, разместившейся погреться на теплом капоте.

Автосигнализация с обратной связью практически лишена упомянутых недостатков. Сигнал с охранного комплекса поступает на портативный брелок, находящийся у владельца. В зависимости от функциональности модели, брелок способен информировать о посягательстве на автомобиль мерцанием светодиодов или выводить информацию на жидкокристаллический дисплей.

Автомобильные сигнализации с обратной связью также могут демонстрировать зону, откуда поступила тревога. В моделях с экраном «классическим» вариантом отображения является схематичное изображение автомобиля, на котором знаком показывается датчик, подавший сигнал тревоги. Это могут быть ручки автомобиля, багажник, капот, салон и иные зоны «триггеры». Также отдельная пиктограмма (как правило, символичное изображение молотка), демонстрирует работу датчика удара.

Такие «сигналки» отличаются своим функциональным наполнением, предлагая не только разнообразный функционал охранных функций, но и систем оповещения водителя. Собственно говоря, в зависимости от совокупности данных характеристик, и стоит выбирать сигнализацию для своего автомобиля.

Важным параметром в выборе является «дальнобойность» системы, то есть расстояние, на котором обеспечивается устойчивая связь охранного комплекса с брелоком. Выбирать его требуется в зависимости от расстояния, на котором в большинстве ситуаций находится автомобиль от владельца.

При этом приобретать автомобильную сигнализацию с обратной связью следует «с запасом» по данному критерию, учитывающим фактор наличия препятствий на пути сигнала (к примеру, наличие стен дома, корпуса гаража и прочего).

Наиболее простые модели таких автосигнализаций имеют небольшой радиус действия брелока, который составляет 300-500 метров. Более передовые технические решения могут работать на расстоянии до двух километров. При выборе стоит уделить внимание и наличию системы GSM-оповещения, которое может сработать, если брелок находится вне зоны приема/передачи сигнала. Как правило, подобные системы отправляют уведомление о «покушении» на автомобиль в формате SMS-сообщения.

Более технологичные охранные комплексы нередко предлагают и более сложные системы в виде программного обеспечения на смартфоне владельца, с помощью которого последний способен не только отслеживать текущее состояние автомобиля, но и его местоположение в случае, если угон все же состоялся.

Помимо данного фактора автосигнализации с обратной связью могут различаться своими возможностями, непосредственно связанными с выполнением охранных функций. Как правило, наиболее простые модели оснащаются функцией центрального замка, блокировкой двигателя и стартера, датчиком удара и «антихайджеком» – датчиком, фиксирующим попытку подъема автомобиля, что препятствует, к примеру, снятию колес с транспортного средства.

Опционально возможно добавление большого количества иных функций. В их числе – расширенные блокировки электрических систем автомобиля и силового агрегата, системы, автоматически отключающие освещение и поднимающие стекла, а также возможность реализации автозапуска силового агрегата по команде владельца либо с использованием таймера. Нередко встречается и функция турботаймера, которая ставит автомобиль на охрану, дав немного поработать двигателю для охлаждения турбины.

Таким образом, современный рынок автосигнализаций с обратной связью предлагает широчайший спектр решений, среди которых владелец легко сможет найти максимально удобную систему для удовлетворения его требований.

Если загорелся Чек Энджин и погас — в чем может быть дело?

Многих автолюбителей интересует чем отличается Тосол от антифриза.

Что такое одометр https://voditeliauto.ru/poleznaya-informaciya/pribory/odometr-chto-eto-takoe.html в машине.

Видео — выбирать GSM сигнализацию для автомобиля и отказаться от брелка с обратной связью. :


Двусторонние сигнализации для авто бюджетного класса ― 130.com.ua

Стоимость* — от 1000 грн.

Сигнализации daVINCI PHI-300, PHI-330, а также PHI-310, PHI-320, PHI-499 и PHI-350 Dialog — охранные системы бюджетного уровня. Данные двусторонние сигнализации интересны тем, что обладают отличным соотношением цена-функционал. При небольшой стоимости сигнализации daVINCI имеют множество функций, которые отсутствуют даже в более дорогих моделях.

Стандартный набор охранных функций: защита дверей, капота, багажника; датчик удара для защиты от разбития стекла автомобиля; возможность организовать две цепи блокировки двигателя (хотя у многих других систем предусмотрена только одна линия блокировки двигателя).

Дополнительные функции, которые зачастую отсутствуют в бюджетных охранных системах: функция пассивного иммобилайзера, противоразбойная функция; удобно реализована функция бесшумной постановки на охрану с помощью удержания одной кнопки (у многих систем необходимо последовательно нажать две кнопки).

Смотрите видеообзоры автосигнализаций:

Реализована функция постановки на охрану без брелока, — машина становится на охрану с помощью служебной кнопки VALET с последующим выходом из машины и захлопыванием дверей. Это необходимо, если в брелоке села батарейка, которую нет возможности заменить в данный момент, либо хозяин оставляет машину в месте, где есть подозрение перехвата сигнала код-грабером (электронная «отмычка» для взлома сигнализаций с последующим проникновением в салон авто). Также реализовано снятие охраны без брелока путем открытия двери автомобиля, включения замка зажигания и кнопки VALET по определенной процедуре.

Еще одна интересная противоугонная функция — в скрытом месте можно поставить тумблер, при включении которого сигнализация активирует блокировку двигателя и эту блокировку нельзя отключить ни с помощью брелока, ни с помощью служебной кнопки VALET.

У систем динамический код (кроме PHI-350 Dialog), то есть, при каждой постановке/снятии на/с охраны код видоизменяется — это затрудняет использование обычных, примитивных код-граберов. Обмен данными автосигнализации с брелоками происходит на частоте 433 МГц.

Жидкокристаллические брелоки сигнализаций daVINCI негромоздкие, имеют средние размеры и удобное расположение кнопок. Стоит отметить, что на брелоках daVINCI PHI-300, PHI-330 и PHI-350 Dialog для крепления к ключам есть металлическое ушко, являющееся частью корпуса и оно не вырвется при длительной эксплуатации, в отличие от множества других систем, где прикреплен карабин, который со временем нередко отламывается. На брелоках этих моделей предусмотрена блокировка кнопок.

Перечисленными выше достоинствами обладает автосигнализация daVINCI PHI-350 Dialog. Стоит отметить две основные отличительные особенности — наличие двух брелоков с ЖК-дисплеем и более мощный диалоговый алгоритм обмена данными (по сравнению с динамическим кодом других моделей daVINCI). Наличие диалогового кода и дополнительного полноценного ЖК-брелока у daVINCI PHI-350 Dialog, возможно, станут решающими факторами при выборе бюджетной автомобильной охранной системы.

Установка. Сигнализации daVINCI удобны и просты в установке, которую могут выполнить специалисты с начальной квалификацией. Центральный блок сигнализации очень компактных размеров — это позволяет установить его в любом удобном скрытом месте. Несмотря на то, что блок компактен, он имеет силовые выходы на центральные замки и указатели поворотов повторители — это несомненный плюс. Системы имеют хорошо сконструированный датчик удара, некритичный к месту размещения, — он в любом случае будет чувствительным. В системах daVINCI достаточно понятное программирование функций. Данные сигнализации можно рекомендовать к установке на бюджетные модели автомобилей. Если в машине есть ценные вещи, то на сигнализации в автомобиль лучше не экономить. Купить двустороннюю сигнализацию в Одессе, Харькове и Киеве можно на 130.com.ua с доставкой по Украине.

Стоимость на 130.com.ua

Материалы по теме

GSM сигнализация с обратной двусторонней связью

GSM сигнализация с обратной связью — это устройство, позволяющее не только контролировать частную территорию, получая уведомления при обнаружении активности, но и связываться с людьми в зоне контроля.

Для этого в конструкции GSM сигнализации с двухсторонней связью имеется динамик и микрофон. В этом случае, фактически, сигнализация GSM с обратной связью используется как телефон для переговоров.

Оформите заказ на GSM сигнализация с обратной двусторонней связью на нашем сайте и мы доставим вам его курьером или почтой по всей России.


Особенности GSM сигнализации с обратной связью

В нашем интернет магазине имеется большой выбор моделей GSM сигнализации с обратной связью. Можно выбрать и купить GSM сигнализацию с обратной связью для дачи, квартиры, офиса.

GSM сигнализация с двухсторонней связью также подойдет для коммерческих объектов, складов, магазинов, чтобы в реальном времени связываться с сотрудниками со своего мобильного телефона. 
 

 


 

При выборе GSM сигнализации с двухсторонней связью следует учитывать несколько особенностей:
  • Проводной или беспроводной тип подключения.
     
  • Громкость и качество звука в динамиках.
     
  • Качество захвата звука микрофоном.
     
  • Формат, тип и рабочие параметры датчиков движения.
     
  • Возможность ручной регулировки громкости звука в динамиках.
     
  • Возможность расширения системы дополнительными датчиками и микрофонами.
     
  • Простота монтажа и настройки системы.
     
  • Доступные средства управления. Например, СМС команды, ДУ брелоки, голосовое управление, приложение на смартфоне.
     
  • Отзывы покупателей о работе GSM сигнализации с двухсторонней связью.


Можно выбрать GSM сигнализацию для дачи с двухсторонней связью, чтобы не беспокоиться о безопасности загородного дома в период своего отсутствия.
При тревоге, владелец узнает о ней из оповещения на мобильном телефоне, сможет связаться с GSM сигнализацией, чтобы прослушать обстановку, либо вызвать охрану и узнать о ситуации на объекте, связавшись с находящимися на месте сотрудниками.


Характеристики GSM сигнализации с обратной двухсторонней связью

Прежде чем купить GSM сигнализацию с обратной или двухсторонней связью, следует просмотреть список характеристик:

  • Радиус захвата микрофона.
     
  • Громкость динамиков.
     
  • Количество зон контроля.
     
  • Количество абонентских номеров для оповещения.
     
  • Параметры энергопотребления, напряжения, мощности аккумулятора.
     
  • Диапазон от самой низкой до самой высокой рабочей температуры.
     
  • Предел относительной влажности воздуха.
     
  • Точные габариты и вес.


Эти критерии помогут сделать правильный выбор, чтобы GSM сигнализация с двухсторонней связью обеспечила безопасность и качественную передачу звука, при этом имея оптимальное соотношение цены и качества.

Также рекомендуем посмотреть:

Регулирование обратной связи в передаче сигналов клетками: уроки для терапии рака трансдукция сигнала.

Обратная связь обеспечивает адаптацию, надежность и сложное динамическое поведение.

Скрытая обратная связь создается белок-белковыми взаимодействиями в сигнальных каскадах.

Лекарственная устойчивость часто возникает из-за вызванных лекарствами нарушений контроля с обратной связью.

Разработка эффективных комбинаций препаратов требует учета регулирования с обратной связью.

Abstract

Понятие обратной связи является фундаментальным для понимания сетей передачи сигналов. Петли обратной связи ослабляют или усиливают сигналы, изменяют динамику сети и модифицируют отношения ввода-вывода между сигналом и целью.Отрицательная обратная связь обеспечивает устойчивость к шуму и адаптацию к возмущениям, но как палка о двух концах может помешать эффективному ингибированию пути лекарственным средством. Положительная обратная связь вызывает сетевые ответы, подобные переключателям, и может преобразовывать аналоговые входные сигналы в цифровые выходные, запуская решения о судьбе клеток и фенотипические изменения. Мы показываем, как множество белок-белковых взаимодействий создает скрытые петли обратной связи в каскадах передачи сигнала. Медикаментозное лечение, нарушающее регуляцию обратной связи, может вызвать неожиданные побочные эффекты.Комбинаторные молекулярные взаимодействия, генерируемые перекрестными путями и петлями обратной связи, часто обходят блокаду, вызванную таргетной терапией против онкогенных мутантных киназ. Мы обсуждаем механизмы лекарственной устойчивости, вызванной сетевой адаптацией, и предполагаем, что разработка эффективных комбинаций лекарств требует понимания того, как петли обратной связи модулируют реакцию на лекарства.

Ключевые слова

Ключевые слова Регулирование

Обратная связь

Системы Стабильность

Математическое моделирование

Математическое моделирование

Анализ сети

Устойчивость к наркотичению, передача сигналов, трансдукция сетевой динамики

Собеты

MST2

MAMMALIAL STE20-ALECTOR CLEAN CINASE 2

RAF-1

V-RAF -1 муюсин лейкемию вирусный онкогенный гомолог 1

МЭК

, активированный митоген, активированный митоген, активированный митоген, активированный митоген. КИНАЗА, КИНАЗА / Внеклеточно-регулируемая сигнальная киназа Kinase

ERK

КИНАЗЕЛЬНАЯ КИНАЗА

ERK

КИНАЗА Kinase

Lats1

Большой опухоль Супрессор Kinase 1

RKIP

RAF Ингибитор ингибитора киназы

RSKP90

рибосомальный S6 Kinase 2

IEGS

Немедленные ранние гены

DUSPS

Двойная специфичность фосфатазы

IRS

инсулин рецепторные субстраты

MTORC1

MAMMALE MAMMALE CLADEL COMPUTION COMBER 1

AKT

белок киназы B (PKB)

PI3K

фосфонозитид 3-киназа

GAB1

GRB2 — Ассоциированный связывающий белок 1

Cdk

Cyclin -Dependen Kinase

Рекомендуемые статьи

Полный текст

Copyright © 2015 Elsevier Ltd.Все права защищены.

Обратная регуляция передачи сигналов лимфоцитов

  • Kurosaki, T. Генетический анализ передачи сигналов В-клеточного антигенного рецептора. год. Преподобный Иммунол. 17 , 555–592 (1999).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Мак, Т. В., Пеннингер, Дж. М. и Охаши, П. С. Нокаутные мыши: сдвиг парадигмы в современной иммунологии. Nature Rev. Immunol. 1 , 11–19 (2001).

    КАС Статья Google ученый

  • Маршалл, С. Дж. Специфичность передачи сигналов рецепторной тирозинкиназы: переходная по сравнению с устойчивой активацией киназы, регулируемой внеклеточным сигналом. Cell 80 , 179–185 (1995).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Адачи, С. и Ивата, М. Продолжительность сигналов кальцинейрина и Erk регулирует приверженность тимоцитов к линии CD4/CD8. Сотовый. Иммунол. 215 , 45–53 (2002).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Шарп, Л.Л., Шварц, Д.А., Ботт, С.М., Маршалл, С.Дж. и Хедрик, С.М. Влияние пути МАРК на приверженность линии Т-клеток. Иммунитет 7 , 609–618 (1997).

    КАС пабмед Статья ПабМед Центральный Google ученый

  • Сугавара Т., Моригучи Т., Нисида Э. и Такахама Ю. Различная роль путей ERK и p38 MAP киназы в положительной и отрицательной селекции Т-лимфоцитов. Иммунитет 9 , 565–574 (1998).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Xu, R., Seger, R. & Pecht, I. Передний край: киназа, регулируемая внеклеточным сигналом, активирует Syk: новая потенциальная регуляция обратной связи передачи сигналов рецептора Fcε. Дж. Иммунол. 163 , 1110–1114 (1999).

    КАС пабмед Google ученый

  • Brummer, T., Naegele, H., Reth, M. & Misawa, Y. Идентификация новых ERK-опосредованных сайтов фосфорилирования по принципу обратной связи на C-конце B-Raf. Онкоген 22 , 8823–8834 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Ролли В.и другие. Амплификация передачи сигналов В-клеточного антигенного рецептора с помощью петли положительной обратной связи Syk/ITAM. Мол. Cell 10 , 1057–1069 (2002). Реконструируя сигнальные пути В-клеточного рецептора (BCR) в клетках Drosophila S2, авторы дают представление о механизмах фосфорилирования иммунорецепторного мотива активации на основе тирозина (ITAM) и определяют задействованную петлю положительной обратной связи. при активации SYK.

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Сайто, К.и другие. BTK регулирует синтез PtdIns-4,5-P2: важность для передачи сигналов кальция и активности PI3K. Иммунитет 19 , 669–678 (2003). Авторы идентифицируют тирозинкиназу Брутона (BTK) как стимулятор петли положительной обратной связи, которая не только обеспечивает поставку субстрата для активатора BTK фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), но также помогает поддерживать активность эффекторов BTK, таких как фосфолипаза. C-γ (PLC-γ).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Линч, Д.К. и Дейли, Р. Дж. Отрицательная обратная связь, опосредованная PKB, жестко регулирует передачу митогенных сигналов через Gab2. EMBO J. 21 , 72–82 (2002).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Лакс И. и др. Стыковочный белок FRS2α контролирует опосредованный MAP-киназой механизм отрицательной обратной связи для передачи сигналов рецепторами FGF. Мол. Cell 10 , 709–719 (2002).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Рет, М.и Винандс, Дж. Инициация и обработка сигналов от рецептора антигена В-клеток. год. Преподобный Иммунол. 15 , 453–479 (1997).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Феррелл, Дж. Э., младший. Самовоспроизводящиеся состояния при передаче сигнала: положительная обратная связь, двойная отрицательная обратная связь и бистабильность. Курс. мнение Клеточная биол. 14 , 140–148 (2002).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Поусон Т.и Скотт, Дж. Д. Передача сигналов через каркас, заякоривание и адаптерные белки. Наука 278 , 2075–2080 (1997).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Джордан М.С., Сингер А.Л. и Корецки Г.А. Адаптеры как центральные медиаторы передачи сигнала в иммунных клетках. Натур Иммунол. 4 , 110–116 (2003).

    КАС Статья Google ученый

  • Шлезингер, Дж.Трансдукция сигнала. Автоингибирование управления. Наука 300 , 750–752 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Harrison, SC Вариация на тему Src. Cell 112 , 737–740 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Хоф П., Плюски С., Де-Паганон С., Экк М.J. & Shoelson, SE. Кристаллическая структура тирозинфосфатазы SHP-2. Cell 92 , 441–450 (1998).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Стофега, М. Р., Аргецингер, Л. С., Ван, Х., Ульрих, А. и Картер-Су, К. Негативная регуляция передачи сигналов рецептора гормона роста/JAK2 сигнальным регуляторным белком α. Дж. Биол. хим. 275 , 28222–28229 (2000).

    КАС пабмед Google ученый

  • Нил, Б.Г., Гу, Х. и Пао, Л. Новости Shp’ing: тирозинфосфатазы, содержащие домен Sh3, в передаче сигналов клетки. Тенденции биохим. науч. 28 , 284–293 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Blasioli, J., Paust, S. & Thomas, M.L. Определение сайтов взаимодействия между протеинтирозинфосфатазой SHP-1 и CD22. Дж. Биол. хим. 274 , 2303–2307 (1999).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Meng, T.C., Fukada, T. & Tonks, N.K. Обратимое окисление и инактивация протеинтирозинфосфатаз in vivo . Мол. Cell 9 , 387–399 (2002).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Таката, М.и другие. Тирозинкиназы Lyn и Syk регулируют связанную с В-клеточным рецептором мобилизацию Ca 2+ посредством различных путей. EMBO J. 13 , 1341–1349 (1994).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Cornall, R.J., Cheng, A.M., Pawson, T. & Goodnow, C.C. Роль Syk в развитии B-клеток и передаче сигналов антиген-рецептор. Проц. Натл акад. науч. США 97 , 1713–1718 (2000).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Kurosaki, T. et al. Роль сайта аутофосфорилирования Syk и доменов Sh3 в передаче сигналов В-клеточного антигенного рецептора. Дж. Экспл. Мед. 182 , 1815–1823 (1995).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Кешвара Л. М., Исааксон К., Харрисон М. Л. и Геален Р. Л.Активация и диссоциация Syk от В-клеточного антигенного рецептора опосредуется фосфорилированием тирозина 130. J. Biol. хим. 272 , 10377–10381 (1997).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Furlong, M. T. et al. Идентификация основных сайтов аутофосфорилирования мышиной протеинтирозинкиназы Syk. Биохим. Биофиз. Acta 1355 , 177–190 (1997).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Хонг, Дж. Дж., Янки, Т. М., Харрисон, М. Л. и Геален, Р. Л. Регулирование передачи сигналов в В-клетках посредством фосфорилирования Syk на тирозинах линкерной области. Механизм отрицательной передачи сигналов тирозинкиназой Lyn. Дж. Биол. хим. 277 , 31703–31714 (2002).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Янки, Т.М., Кешвара, Л.М., Савасдикосол, С., Харрисон, М.Л. и Геален, Р.Л. Ингибирование передачи сигналов через В-клеточный антигенный рецептор продуктом протоонкогена, c-Cbl, требует Syk тирозина 317 и фосфотирозин-связывающего домена c-Cbl. . Дж. Иммунол. 163 , 5827–5835 (1999).

    КАС пабмед Google ученый

  • Flaswinkel, H. & Reth, M. Двойная роль мотива активации тирозина белка Ig-α во время передачи сигнала через антигенный рецептор В-клеток. EMBO J. 13 , 83–89 (1994).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Сайджо, К. и др. Существенная роль протеинтирозинкиназ семейства Src в активации NF-κB во время развития В-клеток. Натур Иммунол. 4 , 274–279 (2003).

    КАС Статья Google ученый

  • Краус, М.и другие. Вмешательство в фосфорилирование мотива активации иммунорецептора иммуноглобулина (Ig)α на основе тирозина (ITAM) модулирует или блокирует развитие В-клеток, в зависимости от наличия цитоплазматического хвоста Igβ. Дж. Экспл. Мед. 194 , 455–469 (2001).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Кэмпбелл, С.Л., Хосрави-Фар, Р., Россман, К.Л., Кларк, Г.Дж. и Дер, К.J. Увеличение сложности передачи сигналов Ras. Онкоген 17 , 1395–1413 (1998).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Hancock, JF Ras белки: разные сигналы из разных мест. Nature Rev. Мол. Клеточная биол. 4 , 373–384 (2003).

    КАС Статья Google ученый

  • Хамад, Н.М. и др. Различные требования к онкогенезу Ras в клетках человека и мыши. Гены Дев. 16 , 2045–2057 (2002).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Shaw, A.C., Swat, W., Ferrini, R., Davidson, L. & Alt, F.W. Активированный Ras сигнализирует о развитии рекомбиназо-активирующего гена (RAG)-дефицитных про-B-лимфоцитов. Дж. Экспл. Мед. 189 , 123–129 (1999).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Gold, M. R. Вырабатывать антитела или нет: передача сигналов рецептором антигена B-клеток. Trends Pharmacol. науч. 23 , 316–324 (2002).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Альберола-Ила, Дж. и Эрнандес-Ойос, Г. Каскад Ras/MAPK и контроль положительного отбора. Иммунол. 191 , 79–96 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Dower, N. A. et al. RasGRP необходим для дифференцировки тимоцитов мыши и передачи сигналов TCR. Натур Иммунол. 1 , 317–321 (2000).

    КАС Статья Google ученый

  • Приатель, Дж. Дж., Тех, С. Дж., Дауэр, Н.A., Stone, JC и Teh, HS RasGRP1 передает сигналы TCR низкого уровня, которые имеют решающее значение для развития, гомеостаза и дифференцировки Т-клеток. Иммунитет 17 , 617–627 (2002).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Oh-Hora, M., Johmura, S., Hashimoto, A., Hikida, M. & Kurosaki, T. Потребность в Ras-гуанин-нуклеотид-высвобождающем белке 3 в связывании фосфолипазы C-γ2 с Ras в рецепторе В-клеток сигнализация. Дж. Экспл. Мед. 198 , 1841–1851 (2003 г.).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Маргарит, С. М. и др. Структурные доказательства активации обратной связи Ras. GTP Ras-специфического фактора обмена нуклеотидов SOS. Cell 112 , 685–695 (2003). Кристаллографический анализ, показывающий тройной комплекс «сын семи» (SOS)–RAS, в котором одна молекула RAS связана с каталитическим модулем SOS, а одна молекула RAS-GTP связана с регуляторным центром, удаленным от активного центра SOS.Это указывает на то, что RAS-GTP аллостерически стабилизирует активный сайт SOS и опосредует механизм положительной обратной связи для пространственной и временной регуляции RAS.

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Фруман, Д. А., Саттертуэйт, А. Б. и Витте, О. Н. Xid-подобные фенотипы: формируется сигналосома В-клетки. Иммунитет 13 , 1–3 (2000).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Шварцберг, П.L. Усиление сигнала Btk. Иммунитет 19 , 634–636 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Healy, J. I. & Goodnow, C. C. Положительная и отрицательная передача сигналов антигенными рецепторами лимфоцитов. год. Преподобный Иммунол. 16 , 645–670 (1998).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Галм О., Yoshikawa, H., Esteller, M., Osieka, R. & Herman, JG. SOCS-1, негативный регулятор передачи сигналов цитокинов, часто подавляется метилированием при множественной миеломе. Кровь 101 , 2784–2788 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Hibbs, M.L. et al. Устойчивая активация тирозинкиназы Lyn in vivo приводит к аутоиммунитету. Дж. Экспл. Мед. 196 , 1593–1604 (2002).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Cornall, R. J. et al. Полигенные аутоиммунные признаки: Lyn, CD22 и SHP-1 являются лимитирующими элементами биохимического пути, регулирующего передачу сигналов и отбор BCR. Иммунитет 8 , 497–508 (1998).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • О’Киф, Т.Л., Уильямс, Г.Т., Дэвис, С.Л. и Нойбергер, М.С. Гиперреактивные В-клетки у мышей с дефицитом CD22. Наука 274 , 798–801 (1996).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Ничке, Л., Карсетти, Р., Окер, Б., Колер, Г. и Ламерс, М. С. CD22 является негативным регулятором передачи сигналов В-клеточного рецептора. Курс. биол. 7 , 133–143 (1997). В ссылках с 48 по 51 представлен подробный генетический и биохимический анализ петли отрицательной обратной связи LYN-CD22-SHP1 в В-клетках.

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Kang, S.W. et al. PKCβ модулирует передачу сигналов антигенного рецептора посредством регуляции мембранной локализации Btk. EMBO J. 20 , 5692–5702 (2001). В этой работе представлен молекулярный механизм, с помощью которого протеинкиназа C-β (PKC-β) подавляет индуцированную BCR активность BTK посредством серинового фосфорилирования BTK как части петли отрицательной обратной связи.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Коше, К., Gill, G.N., Meisenhelder, J., Cooper, J.A. & Hunter, T. C-киназа фосфорилирует рецептор эпидермального фактора роста и снижает активность его тирозинкиназы, стимулируемую эпидермальным фактором роста. Дж. Биол. хим. 259 , 2553–2558 (1984).

    КАС пабмед Google ученый

  • Muller, R., Wienands, J. & Reth, M. Остатки серина и треонина в цитоплазматическом хвосте Ig-α негативно регулируют передачу сигнала, опосредованную мотивом активации иммунорецептора на основе тирозина. Проц. Натл акад. науч. США 97 , 8451–8454 (2000).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Лош, Ф. О. и др. Активация Т-клеток через специфические химерные рецепторы опухолевого антигена: роль внутриклеточного сигнального домена. Междунар. Дж. Рак 103 , 399–407 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Аллуш, М.Основной фактор роста фибробластов и гемопоэз. Лейкемия 9 , 937–42 (1995).

    КАС пабмед Google ученый

  • де Хаан, Г. и др. Получение in vitro длительно репопуляционных гемопоэтических стволовых клеток с помощью фактора роста фибробластов-1. Дев. Cell 4 , 241–251 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Кронфельд И., Kazimirsky, G., Gelfand, E.W. & Brodie, C. NGF спасает В-лимфоциты человека от анти-IgM-индуцированного апоптоза путем активации PKCζ. евро. Дж. Иммунол. 32 , 136–143 (2002).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Гу, Х. и Нил, Б.Г. «Гэб» в передаче сигнала. Trends Cell Biol. 13 , 122–130 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Эррера, Р.и Себолт-Леопольд, Дж. С. Разгадка сложностей пути киназы Raf / MAP для фармакологического вмешательства. Тенденции Мол. Мед. 8 , С27–С31 (2002).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Иритани, Б. М., Альберола-Ила, Дж., Форбуш, К. А. и Перимуттер, Р. М. Отчетливые сигналы опосредуют созревание и исключение аллелей в лимфоцитах-предшественниках. Иммунитет 10 , 713–722 (1999).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Rui, L., Vinuesa, C.G., Blasioli, J. & Goodnow, C.C. Устойчивость к CpG-ДНК-индуцированному аутоиммунитету посредством передачи сигналов ERK толерогенного антигенного рецептора B-клеток. Натур Иммунол. 4 , 594–600 (2003).

    Артикул КАС Google ученый

  • Флеминг, Х. Э.& Paige, C.J. Передача сигналов рецептора пре-В-клеток опосредует избирательный ответ на IL-7 при переходе от про-В-клетки к пре-В-клетке через ERK/MAP-киназ-зависимый путь. Иммунитет 15 , 521–531 (2001).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Флемминг А., Браммер Т., Рет М. и Джумаа Х. Адаптерный белок SLP-65 действует как супрессор опухоли, который ограничивает размножение пре-В-клеток. Натур Иммунол. 4 , 38–43 (2003).

    КАС Статья Google ученый

  • Гарднер, А. М., Вайланкур, Р. Р., Ланге-Картер, С. А. и Джонсон, Г. Л. Фосфорилирование MEK-1 киназой MEK, Raf и митоген-активируемой протеинкиназой: анализ фосфопептидов и регуляция активности. Мол. биол. Cell 5 , 193–201 (1994).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Мансур, С.Дж. и др. Митоген-активированный протеин (MAP) киназы фосфорилирования киназы MAP киназы: определение сайтов фосфорилирования с помощью масс-спектрометрии и сайт-направленного мутагенеза. J. Biochem. (Токио) 116 , 304–314 (1994).

    КАС Статья Google ученый

  • Clemens, J.C. et al. Использование двухцепочечной РНК-интерференции в клеточных линиях дрозофилы для анализа путей передачи сигнала. Проц.Натл акад. науч. США 97 , 6499–6503 (2000).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Рой Ф., Лаберж Г., Дузих М., Ферланд-МакКоллоу Д. и Терриен М. KSR — это каркас, необходимый для активации модуля ERK/MAPK. Гены Дев. 16 , 427–438 (2002).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Алесси, Д.R., Cuenda, A., Cohen, P., Dudley, D.T. & Saltiel, A.R. PD 098059 представляет собой специфический ингибитор активации митоген-активируемой протеинкиназы in vitro и in vivo . Дж. Биол. хим. 270 , 27489–27494 (1995).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Wartmann, M., Hofer, P., Turowski, P., Saltiel, A.R. & Hynes, N.E. Негативная модуляция мембранной локализации протеинкиназы Raf-1 путем гиперфосфорилирования. Дж. Биол. хим. 272 , 3915–3923 (1997).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Браммер, Т., Шоу, П. Е., Рет, М. и Мисава, Ю. Индуцибельная делеция гена выявляет различные роли B-Raf и Raf-1 в передаче сигналов антигенного рецептора В-клеток. EMBO J. 21 , 5611–5622 (2002).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Уэки, К.и другие. Регуляция по обратной связи активности киназы киназы митоген-активируемой протеинкиназы c-Raf-1 путем стимуляции инсулином и форболовым эфиром. Дж. Биол. хим. 269 , 15756–15761 (1994).

    КАС пабмед Google ученый

  • Waters, S.B. et al. Десенсибилизация активации Ras путем обратной диссоциации комплекса SOS-Grb2. Дж. Биол. хим. 270 , 20883–20886 (1995).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Корбалан-Гарсия, С., Ян С.С., Дегенхардт К.Р. и Бар-Саги Д. Идентификация сайтов фосфорилирования митоген-активируемой протеинкиназы на Sos1 человека, которые регулируют взаимодействие с Grb2. Мол. Клетка. биол. 16 , 5674–5682 (1996).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Douville, E. & Downward, J. Индуцированное EGF фосфорилирование SOS в клетках PC12 включает P90 RSK-2. Онкоген 15 , 373–383 (1997).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Harmer, S.L. & DeFranco, A.L. Shc содержит два сайта связывания Grb2, необходимые для эффективного образования комплексов с SOS в В-лимфоцитах. Мол. Клетка. биол. 17 , 4087–4095 (1997).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Д’Анджело, Г. и др.16К человеческого пролактина ингибирует индуцированную фактором роста эндотелия сосудов активацию Ras в капиллярных эндотелиальных клетках. Мол. Эндокринол. 13 , 692–704 (1999).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Уотерс, С. Б., Ямаути, К. и Пессин, Дж. Э. Стимулируемая инсулином диссоциация комплекса SOS-Grb2. Мол. Клетка. биол. 15 , 2791–2799 (1995).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Будай Л., Warne, P.H. & Downward, J. Понижающая регуляция пути активации Ras путем фосфорилирования MAP-киназы Sos. Онкоген 11 , 1327–1331 (1995).

    КАС пабмед Google ученый

  • Zhang, W., Sloan-Lancaster, J., Kitchen, J., Trible, R. P. & Samelson, L. E. LAT: субстрат тирозинкиназы ZAP-70, который связывает рецептор Т-клеток с клеточной активацией. Cell 92 , 83–92 (1998).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Langlois, WJ, Sasaoka, T., Saltiel, A.R. & Olefsky, JM. Регулирование с отрицательной обратной связью и десенсибилизация инсулино- и эпидермального фактора роста, стимулируемого активацией p21ras. Дж. Биол. хим. 270 , 25320–25323 (1995).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Александр, В.S. Супрессоры передачи сигналов цитокинов (SOCS) в иммунной системе. Nature Rev. Immunol. 2 , 410–416 (2002).

    КАС Статья Google ученый

  • Хоффманн А., Левченко А., Скотт М.Л. и Балтимор Д. Сигнальный модуль IκB-NF-κB: временной контроль и селективная активация генов. Наука 298 , 1241–1245 (2002).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Раветч, Дж.В. и Ланье, Л. Л. Иммунные ингибирующие рецепторы. Наука 290 , 84–89 (2000).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Reth, M. Перекись водорода как вторичный мессенджер в активации лимфоцитов. Натур Иммунол. 3 , 1129–1134 (2002).

    КАС Статья Google ученый

  • Уоттс, Дж.Д., Сангера Дж. С., Пелеч С. Л. и Эберсолд Р. Фосфорилирование серина 59 p56lck в активированных Т-клетках. Дж. Биол. хим. 268 , 23275–23282 (1993).

    КАС пабмед Google ученый

  • Joung, I. et al. Модификация Ser59 в уникальной N-концевой области тирозинкиназы p56lck регулирует специфичность ее домена гомологии 2 Src. Проц. Натл акад. науч. США 92 , 5778–5782 (1995).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Winkler, D.G. et al. Фосфорилирование Ser-42 и Ser-59 в N-концевой области тирозинкиназы p56lck. Проц. Натл акад. науч. США 90 , 5176–5180 (1993).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Стефанова И. и др. Дискриминация лиганда TCR обеспечивается конкурирующими путями положительной обратной связи ERK и отрицательной обратной связи SHP-1. Натур Иммунол. 4 , 248–254 (2003). В этой статье описывается, как T-клеточный рецептор (TCR)-индуцированная активность LCK уравновешивается петлями положительной и отрицательной обратной связи, и обеспечивает физиологическое значение для опосредованного внеклеточной сигнал-регулируемой киназой (ERK) фосфорилирования LCK по типу обратной связи, которое было обнаружено. десятилетием ранее.

    КАС Статья Google ученый

  • Шебеста, М., Хиви, Б.& Busslinger, M. Транскрипционный контроль развития B-клеток. Курс. мнение Иммунол. 14 , 216–223 (2002).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Shaffer, A.L. et al. Blimp-1 управляет дифференцировкой плазматических клеток, подавляя программу экспрессии генов зрелых В-клеток. Иммунитет 17 , 51–62 (2002).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Лин, К.И., Туняплин С. и Каламе К. Регуляторные каскады транскрипции, контролирующие дифференцировку плазматических клеток. Иммунол. Ред. 194 , 19–28 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Морияма, М., Ямоти, Т., Семба, К., Акияма, Т. и Мори, С. BCL-6 фосфорилирован по нескольким сайтам в его серин- и пролин-кластерной области митоген-активируемым белком киназа (MAPK) in vivo . Онкоген 14 , 2465–2474 (1997).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Niu, H., Ye, B. H. & Dalla-Favera, R. Передача сигналов антигенных рецепторов индуцирует опосредованное киназой MAP фосфорилирование и деградацию транскрипционного фактора BCL-6. Гены Дев. 12 , 1953–1961 (1998).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Каламе, К.L. Плазматические клетки: открытие нового света в конце развития В-клеток. Натур Иммунол. 2 , 1103–1108 (2001).

    КАС Статья Google ученый

  • Рао, Н., Додж, И. и Бэнд, Х. Семейство убиквитинлигаз Cbl: критические негативные регуляторы передачи сигналов тирозинкиназы в иммунной системе. Дж. Лейкок. биол. 71 , 753–763 (2002).

    КАС пабмед Google ученый

  • Джанг И.К. и Гу, Х. Негативная регуляция передачи сигналов TCR и активация Т-клеток путем селективной деградации белка. Курс. мнение Иммунол. 15 , 315–320 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Thien, C.B. & Langdon, W.Y. Cbl: множество приспособлений для регулирования протеинтирозинкиназ. Nature Rev. Мол. Клеточная биол. 2 , 294–307 (2001).

    КАС Статья Google ученый

  • Уоттс, Дж.Д. и др. Идентификация с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением сайтов фосфорилирования тирозина, индуцированного в активированных Т-клетках Jurkat на протеинтирозинкиназе ZAP-70. Дж. Биол. хим. 269 , 29520–29529 (1994).

    КАС пабмед Google ученый

  • Мерфи, Массачусетс и др. Гиперплазия тканей и усиленная передача сигналов Т-клетками через ZAP-70 у мышей с дефицитом c-Cbl. Мол. Клеточная биол. 18 , 4872–4882 (1998).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Нарамура, М., Коле, Х.К., Ху, Р.Дж. и Гу, Х. Измененный положительный отбор тимуса и внутриклеточные сигналы у мышей с дефицитом Cbl. Проц. Натл акад. науч. США 95 , 15547–15552 (1998).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Tognon, C.E.и другие. Регуляция RasGRP через чувствительный к эфиру форбола домен C1. Мол. Клетка. биол. 18 , 6995–7008 (1998).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Su, YW & Jumaa, H. LAT связывает pre-BCR с передачей сигналов кальция. Иммунитет 19 , 295–305 (2003).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Нииро, Х., Maeda, A., Kurosaki, T. & Clark, EA. Адаптерная молекула B-лимфоцитов 32 кДа (Bam32) регулирует передачу сигналов рецептора антигена B-клеток и выживание клеток. Дж. Экспл. Мед. 195 , 143–149 (2002).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Han, A., Saijo, K., Mecklenbrauker, I., Tarakhovsky, A. & Nussenzweig, M.C. Bam32 связывает рецептор В-клеток с ERK и JNK и опосредует пролиферацию В-клеток, но не выживание. Иммунитет 19 , 621–632 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Reynolds, L. F. et al. Vav1 преобразует сигналы Т-клеточного рецептора в активацию пути Ras/ERK через LAT, Sos и RasGRP1. Дж. Биол. хим. (в печати)

  • Adachi, T. et al. SHP-1 требует, чтобы ингибирующие корецепторы подавляли фосфорилирование клеточных субстратов, опосредованное В-клеточным антигенным рецептором. Дж. Биол. хим. 276 , 26648–26655 (2001).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Мидзуно, К. и др. Область гомологии Src 2 (Sh3), содержащая домен фосфатазы-1, дефосфорилирует линкерный белок В-клеток/белок лейкоцитов домена Sh3 массой 65 кДа и селективно регулирует активацию Nh3-концевой киназы c-Jun в В-клетках. Дж. Иммунол. 165 , 1344–1351 (2000).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Пани, Г., Козловски, М., Камбье, Дж. К., Миллс, Г. Б. и Симинович, К. А. Идентификация тирозинфосфатазы PTP1C как белка, ассоциированного с рецептором антигена В-клеток, участвующего в регуляции передачи сигналов В-клеток. Дж. Экспл. Мед. 181 , 2077–2084 (1995).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Cyster, J. G. & Goodnow, C. C. Протеиновая тирозинфосфатаза 1C негативно регулирует передачу сигналов антигенных рецепторов в B-лимфоцитах и ​​определяет пороги отрицательной селекции. Иммунитет 2 , 13–24 (1995).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Doody, G.M. et al. Роль CD22 и протеинтирозинфосфатазы SHP в активации В-клеток. Наука 269 , 242–244 (1995).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Обнаружена скрытая обратная связь в сигнальных каскадах

    Abstract

    Циклы, включающие ковалентную модификацию белков, являются ключевыми компонентами внутриклеточного сигнального механизма.Каждый цикл состоит из двух взаимопревращаемых форм определенного белка. Классический сигнальный путь структурирован цепью или каскадом звеньев основного цикла таким образом, что активированный белок в одном цикле способствует активации следующего белка в цепи и так далее. Начав с механистического кинетического описания и используя тщательный анализ возмущений, мы впервые, насколько нам известно, получили последовательное приближение цепи с одной переменной на цикл.Полученная нами модель отличается от той, которая использовалась в литературе в течение нескольких лет и является феноменологическим расширением биохимического переключателя Гольдбетера-Кошланда. Несмотря на то, что многое было сделано в отношении математического моделирования этих систем, наш вклад заполняет пробел между существующими моделями, и при этом мы раскрыли важные новые свойства этого типа сигнальных каскадов. Ключевой особенностью нашей новой модели является то, что отрицательная обратная связь возникает естественным образом между каждым циклом и его предшественником.Благодаря этой отрицательной обратной связи система проявляет затухающие временные колебания при постоянной стимуляции и, самое главное, распространяет возмущения как вперед, так и назад. Этот последний атрибут бросает вызов широко распространенному представлению об однонаправленности сигнальных каскадов. Обсуждаются конкретные примеры приложений к каскадам MAPK. Все эти свойства присущи полному механистическому описанию и нашей упрощенной модели, но не ранее выведенным феноменологическим моделям сигнальных каскадов.

    Резюме автора

    Сотовая передача сигналов осуществляется сложной сетью взаимодействий. Структура, которая обычно встречается в сигнальных путях, представляет собой последовательность циклов включения-выключения между двумя состояниями одного и того же белка, называемая каскадом. Анализируя и обобщая основные кинетические уравнения этой системы, мы построили новую математическую модель внутриклеточного сигнального каскада. Широко признано, что по сигнальным путям информация перемещается как снаружи внутрь, так и изнутри наружу.И наоборот, каскады, даже будучи основными компонентами этих путей, до сих пор понимались как структуры, в которых передача сигнала происходит аналогично эффекту домино: информация течет только в одном направлении. До сих пор двунаправленное распространение объяснялось добавлением явных соединений, связывающих определенный уровень с расположением вверх по течению. Другими словами, до сих пор однонаправленные каскады допускали двунаправленное распространение только при включении в более сложные схемы.Предложенная модель показывает, что каскад может естественным образом демонстрировать двунаправленное распространение, не требуя дополнительной повторной проводки. Этот результат вдохновляет на новые интерпретации экспериментальных данных; поскольку сигнальные пути обычно реконструируются из таких данных, этот результат может иметь далеко идущие последствия для понимания клеточной передачи сигналов.

    Образец цитирования: Ventura AC, Sepulcher J-A, Merajver SD (2008) Выявлена ​​скрытая обратная связь в сигнальных каскадах. PLoS Comput Biol 4(3): е1000041.https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000041

    Редактор: Герберт М. Сауро, Вашингтонский университет, Соединенные Штаты Америки

    Получено: 21 сентября 2007 г.; Принято: 20 февраля 2008 г .; Опубликовано: 21 марта 2008 г.

    Авторское право: © 2008 Ventura et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Финансирование: Эта работа была поддержана грантами Программы исследований рака молочной железы Министерства обороны США (ACV), Фонда Burroughs Wellcome Fund (SDM), Фонда исследований рака молочной железы (SDM) и NIH (RO1 CA77612).

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    Циклы ковалентной модификации являются одним из основных внутриклеточных сигнальных механизмов как в прокариотических, так и в эукариотических организмах [1].Сложная передача сигналов происходит через сети сигнальных путей, составленные из цепочек или каскадов таких циклов, в которых активированный белок в одном цикле способствует активации белка в следующем звене цепи. Таким образом, входной сигнал, введенный на одном конце пути, может распространяться, проходя через его строительные блоки, чтобы вызвать один или несколько эффектов в расположении ниже по течению.

    Примерами ковалентной модификации являются метилирование-деметилирование, активация-инактивация GTP-связывающих белков и, вероятно, наиболее изученный процесс фосфорилирование-дефосфорилирование (PD) [1], [2].В таких циклах сигнальный белок активируется добавлением химической группы и инактивируется ее удалением. Этот белок, в свою очередь, модифицируется двумя противоположными ферментами, такими как киназа и фосфатаза для циклов PD. В отсутствие внешней стимуляции существует устойчивый цикл, в котором реакции активации и инактивации уравновешены. Внешние стимулы, вызывающие изменение активности конвертирующих ферментов, сдвигают состояние активации целевого белка, вызывая отклонение от устойчивого состояния, которое может распространяться по каскаду.

    Преимущества этих каскадов в передаче сигнала многочисленны, и сохранение их базовой структуры на протяжении эволюции предполагает их полезность. Реакционный каскад может усиливать слабый сигнал, увеличивать скорость передачи сигналов, увеличивать крутизну профиля входного сигнала по мере его распространения, отфильтровывать шум при приеме сигнала, вводить временную задержку и обеспечивать альтернативные точки входа для дифференциального регулирования. 3]–[5].

    Внутриклеточная передача сигналов через каскады биохимических реакций была предметом большого количества исследований (например,г., [2], [6] для обзоров). Теоретические исследования были мотивированы возросшей потребностью в разработке абстрактной структуры для понимания огромного количества доступных в настоящее время экспериментальных данных. Вся эта область исследований дополнительно мотивирована надеждой охарактеризовать пути, которые не регулируются при таких заболеваниях, как рак, и определить цели для борьбы с этими заболеваниями [7].

    Поскольку стимулы, которые получает клетка, разнообразны и сложны, каскады не работают изолированно, а скорее интеграция стимулов зависит от перекрестных помех между путями.Еще одним важным свойством сигнальных каскадов является их способность интегрировать информацию путем передачи эффектов вниз по течению, а также обратной связи вверх по течению. Несмотря на несколько десятилетий интенсивной работы над сигнальными каскадами, никогда не было построено ни одной модели, демонстрирующей перекрестные помехи с прямой и обратной передачей бокового входа от другого каскада, за исключением случаев, когда обратная связь ad hoc явно добавляется к каскадной модели. Наша модель, построенная на основе первых принципов, естественно демонстрирует эти характеристики и, следовательно, вдохновляет на новые интерпретации экспериментальных данных.

    Хорошо изученным примером каскада циклов активация-инактивация является каскад протеинкиназ. В этом случае основной сигнальной единицей является цикл PD, активирующей киназой которого является фосфорилированный белок предыдущего цикла. Многие белки содержат несколько сайтов фосфорилирования, что обеспечивает большую гибкость регуляции. Так обстоит дело, например, с митоген-активируемым протеинкиназным каскадом (MAPK), который широко участвует в эукариотической передаче сигнала [3], [8]–[10].Для простоты в этой статье мы в основном будем рассматривать каскады, состоящие из простых циклов активации-инактивации с двумя состояниями. Однако также выводятся уравнения, соответствующие каскаду МАПК, и некоторые их свойства сравниваются со свойствами более простых каскадов. Несмотря на то, что наши результаты в целом верны, для циклов ковалентной модификации мы будем использовать номенклатуру, связанную с циклами ПК, , т.е. . конвертирующие ферменты будут обозначаться как киназа/фосфатаза.

    Основное внимание в нашем исследовании уделяется уточнению математического моделирования каскадов циклов ковалентной модификации, таких как изображенный на рисунке 1. Для описания таких каскадов с использованием обыкновенных дифференциальных уравнений было разработано несколько математических описаний. Как правило, эти описания строятся, начиная с модели одного цикла, которая затем феноменологически включается в каскад циклов. Хорошо известная модель для описания одиночного цикла была представлена ​​пионерской работой Гольдбетера и Кошланда (Г.К.) [11].Модель GK считает, что концентрация целевого белка значительно превышает концентрацию конвертирующих ферментов, что сокращает описание до одного уравнения на цикл. Полученная таким образом модель была затем феноменологически распространена на каскад отдельных ГК-циклов. Здесь под названием «феноменологический» мы подразумеваем, что в каскаде прямая связь между циклами ГК выбирается максимально просто, но строго не выводится из первых принципов. Это феноменологическое расширение модели GK будет обозначаться как GK-подобная модель .GK-подобная модель использовалась несколькими авторами для описания динамики передачи сигнала [9], [12]–[16]. Для конкретных предельных случаев модель, подобная GK, может быть дополнительно упрощена, что приводит к модели, в которой реакции взаимного превращения следуют линейным законам скорости с константами скорости первого порядка. Это описание изучалось в нескольких ключевых работах [17]–[19], и мы будем называть его моделью линейных скоростей .

    Рисунок 1. Схематическое изображение каскада циклов ковалентной модификации.

    Цикл i th состоит из двух состояний одного и того же белка: неактивного и активного состояний, обозначенных Y i и Y i * 9278 На каждом этапе активация катализируется активированным продуктом предыдущего этапа. Дезактивация осуществляется другим ферментом, E’ i .

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000041.g001

    Концепция «каскада» в изучении путей трансдукции привлекательна благодаря своей модульной структуре.Что особенно привлекательно, так это возможность определения состояния каскада только одной переменной на модуль. Как упоминалось выше, поскольку строительными блоками GK-подобной модели являются хорошо изученные циклы GK, они включают только одно уравнение на цикл. Однако другой подход заключается в том, чтобы иметь дело с динамикой каскада на рисунке 1, рассматривая полный набор биохимических реакций и записывая соответствующие уравнения без каких-либо предварительных приближений. Это было выполнено, например, для случая МАПК-каскада [8].Мы будем называть этот подход механической моделью . Для целей этой статьи мы будем считать, что механистическая модель представляет собой полное описание изучаемой системы (хотя мы признаем, что в действительности это не модель без гипотез).

    В этой статье, начиная с механистического описания каскада, состоящего из произвольного числа циклов, мы получаем последовательное приближение, при котором каскад описывается с одной переменной на цикл.Оказывается, что в этом выводе, называемом редуцированным механистическим описанием, феноменологическая ГК-подобная модель не восстанавливается. На первый взгляд наше новое приближение несколько отличается от полученного ранее описания сигнальных каскадов. Однако она предполагает качественно отличную динамику от ГК-подобной модели, но при этом очень хорошо согласуется с полным механистическим описанием при выполнении условий аппроксимации.

    Основное отличие нашего упрощенного механистического описания от феноменологического состоит в появлении внутренней обратной связи от каждой единицы к предыдущей, вызванной тем, что в каждом цикле происходит секвестрация части активированного белка предыдущей ступени.Новое описание каскада предсказывает существование затухающих колебаний вдоль цепи — явление, которое невозможно наблюдать с помощью предыдущего феноменологического описания. Интересно, что следствием нашей модели является то, что если конкретное звено в середине цепи получает вход — обычное событие, учитывая высокую степень перекрестных помех между сигнальными путями, — то наше сокращенное механистическое описание предсказывает, что это возмущение может распространяться. как вперед, так и назад. Это «бицистронное» распространение, которое может иметь решающее значение для эффективной эукариотической передачи сигналов, также невозможно в рамках GK-подобного описания.Наша модель обеспечивает подходящую основу для будущих экспериментов по изучению перекрестных помех и бицистронного распространения сигналов.

    Результаты

    Как смоделировать сигнальный каскад

    Механическое описание.

    Мы рассматриваем каскад биохимических циклов, как показано на рисунке 1, в котором две переменные Y i и Y i * представляют собой две взаимопревращаемые формы одного белка, такие как дефосфорилированная и фосфорилированные формы киназы; активированная форма Y i * действует как катализатор следующей реакции.Цикл между Y i и Y i * составляет базовый модуль сигнального пути, который включает n таких элементов. В этом каскаде дезактивация происходит посредством фосфатазы, обозначенной E’ i .

    Поскольку процессы, связанные с контролем продукции новых белков, протекают гораздо медленнее, чем процессы, химически модифицирующие существующие белки, общее количество Y iT считается постоянным во времени, а переменные [ Y i ] и [ Y i * ] (квадратные скобки обозначают концентрацию) затем связаны законом сохранения.Следовательно, только одна из форм Y i или Y i * будет рассматриваться как независимая переменная. Первый модуль активируется внешним входным сигналом, которым может быть, например, фактор роста или уровень гормонов. Уровень последнего белка Y n * можно рассматривать как «выход» системы.

    В идеальной ситуации взаимное превращение белка i в можно описать следующими реакциями: (1) где C i и C’ i являются промежуточными фермент-субстратными комплексы.Здесь законодательство о сохранении для белка, индексированного I Y IT = [ Y I ] + [ Y I ] + [ C I ] + [ C’ i ]+[ C i +1 ]. Обратите внимание, что он включает комплексную концентрацию [ C i +1 ], образующуюся на этапе i +1, поскольку Y i * активирует й цикл.Существует также уравнение сохранения для обратного фермента (фосфатазы), которое можно записать как E’ iT  =  [ E’ i ]+[ C’ i ]. Пять переменных, связанных с модулем I , [ Y I ], [ Y I ], [ C I ], [ C ‘ I ] , [ E ‘ i ], связаны двумя законами сохранения, оставляя в принципе три переменных состояния на цикл.В этом случае кинетические уравнения каскада могут быть записаны с использованием закона действующих масс (см. Текст S1), в результате чего мы назовем механистическую модель.

    Преимущество работы в рамках механистической модели заключается в том, что не требуются никакие математические аппроксимации (хотя в целом это явно не модель без гипотез), и это может быть оптимальным выбором для сравнения экспериментальных данных с численным моделированием модель. Такой вариант был взят, например, в контексте каскада МАПК [8].

    С другой стороны, более сложные модели, хотя в принципе и более реалистичные, также менее пригодны для понимания путей трансдукции. Поэтому интересно выяснить, при каком наборе гипотез механистическая модель может быть аппроксимирована более простой моделью, например моделью с одной переменной за цикл. Получение такого сокращенного описания является основным вкладом настоящей статьи. Прежде чем предоставить это описание, мы кратко рассмотрим некоторые подходы, используемые в литературе для изучения сигнальных каскадов с помощью только одного уравнения на цикл (см. текст S2 для краткого изложения).

    Модель с линейными скоростями.

    Одним из возможных упрощений химических реакций в уравнении 1 является пренебрежение образованием комплексов C i и C’ i . Это может быть оправдано, например, в том случае, когда скорости 91 277 k 91 299 i 91 300 91 278 и 91 277 k’ 91 299 i 91 300 91 278 ‘s значительно превышают другие кинетические константы. Другая точка зрения заключается в предположении, что концентрация каждого фермент-субстратного комплекса очень мала по сравнению с суммарной концентрацией партнеров реакции [17].Пренебрегая этими комплексами в реакциях, а затем используя закон действующих масс, можно записать уравнения динамики цепи следующим образом: (2) с определениями Y IT и Y и * = [ y I * ] / Y IT , Y IT Обозначение общего доступного белка. Y Y 0 * — это нормализованный входной сигнал и параметры α I = A I Y T и β I = A ‘ I E′ i .Уравнение 2 необходимо дополнить уравнением сохранения y i + y i *  = 1, так что здесь действительно имеется одна степень свободы в цикле. Нелинейная система в уравнении 2 рассматривалась несколькими авторами [17]–[19]. Мы называем эту модель моделью линейных ставок.

    Ферментативная модель.

    Модель линейных ставок не учитывает тот факт, что преобразования от Y I в Y I и от Y I * на Y I , катализируются ферментами.Это означает, что образуется промежуточный фермент-субстратный комплекс. Поэтому в литературе рассматривался второй класс уравнений для моделирования цикла ковалентной модификации с явным учетом задействованных ферментативных механизмов. Этот подход впервые был использован в основополагающей работе Гольдбетера и Кошланда [11]. Начиная с механистической модели (но только для одного цикла), можно свести описание к одной переменной, учитывая, что концентрация Y T значительно превышает концентрацию конвертирующих ферментов.Таким образом, комплексами фермент-субстрат можно пренебречь из уравнения сохранения, и они выражаются как функция субстратов только в кинетических уравнениях. Как обычно, этот механизм типа Михаэлиса-Ментен основан на предположении о квазистационарном состоянии скорости изменения комплексов. В результате получается следующее уравнение: (3) где y i + y i *  = 1, а безразмерные коэффициенты Михаэлиса-Ментен определяются как K = (k+9d)/(aY  1) T ) и K′  = ( k′+d′ ) / ( a′Y T ). Феноменологическое расширение этого описания для каскада, подобного показанному на рис. 1, выглядит следующим образом: (4)

    Мы будем называть это обобщение модели Гольдбетера и Кошланда GK-подобной моделью. Отметим, что в случае, когда коэффициенты K i и K’ i намного больше 1, система в уравнении 4 может быть аппроксимирована более простой моделью уравнения 2, представленной ранее.

    Уравнение 3 впервые было получено Гольдбетером и Кошландом для изучения так называемого свойства сверхчувствительности нулевого порядка.Это означает, что когда K малы (например, порядка 10 2 ), цикл ведет себя как переключатель, в котором устойчивое состояние для y * резко переходит от его от самого низкого до самого высокого значения в зависимости от отношения V/V’ .

    Каскадные расширения модели Гольдбетера-Кошланда широко использовались в нескольких важных статьях [9], [12]–[16], охватывающих различные контексты, часто добавляя единственную петлю отрицательной обратной связи, простирающуюся от последнего звена цепи до конечного. первый.Однако утверждалось, что гипотезы, ведущие к цепным уравнениям (уравнение 4), сомнительны [3], [20]. Blüthgen et al. [3] утверждают, что в некоторых случаях текущие экспериментальные данные не поддерживают пренебрежение комплексами фермент-субстрат из уравнения сохранения. Если аффинность киназы Y i * к белку Y i +1 высока, но ее каталитическая активность довольно медленная, то Y i 3 «секвестрированы» в комплексе C i +1 , вызывая уменьшение доступных свободных Y i * .Это явление было названо «секвестрацией», и было показано, что оно может сильно снизить сверхчувствительность цепи. Если важна секвестрация, то динамика, предсказываемая моделью уравнения 4, сильно отличается от динамики, показанной механистической моделью. Подобные аргументы обсуждаются в другой работе [20]. Более того, было указано, что секвестрация части активированного фермента одного цикла следующим имеет эффект «неявной обратной связи» в цепи [20].Эти авторы, однако, не проводят формального анализа этого интуитивного утверждения или его следствий, как это делаем мы в следующем разделе.

    Важность основанной на секвестрации обратной связи в сигнальных каскадах тщательно проанализирована в недавней работе Legewie et al [21], где показано, что механизм положительной обратной связи, возникающий в результате эффектов секвестрации, вызывает бистабильность в каскаде. В этом исследовании секвестрацию вызывают стабильные гетеродимеры, образованные нефосфорилированным белком Y i и следующим субстратом Y i +1 в каскаде.Предполагается, что диссоциация этого гетеродимера индуцируется (дважды) фосфорилированным белком в цикле i +1, что влечет за собой положительную обратную связь «освобождение от ингибирования». Однако в нашем исследовании мы впервые указываем на обратную связь, основанную на секвестрации, которая до сих пор упускалась из виду: она существует в базовой модели каскада MAPK, без задействования какого-либо дополнительного механизма.

    Новое описание сигнальных каскадов

    В тексте S1 мы подробно выводим новый класс уравнений модели, полученный как приближение к механистической модели.Цель нашего подхода состоит в том, чтобы уменьшить количество переменных во всей системе, вводя в игру гипотезу, которая позволяет нам использовать приближение квазистационарного состояния. Для облегчения анализа определены три ключевых безразмерных параметра: (5) ε i и η i представляют собой отношения общего количества белков. ε i — отношение общей фосфатазы к общему целевому белку. η i определяется как отношение общего целевого белка в одном цикле к соответствующему количеству в следующем цикле в каскаде или, что то же самое, отношение общего киназы к общему целевому белку.Параметр µ i представляет собой отношение кинетических скоростей образования продукта как в реакциях активации, так и в реакциях инактивации (см. реакции в уравнении 1).

    Используя стандартный анализ сингулярных возмущений, мы обнаружили, что состояние каждого биохимического цикла может быть описано одной переменной, определяемой как , которая представляет собой естественную медленную переменную, описывающую общую киназу i , доступную в данный момент времени для фосфорилирования в цикле i +1.Это снижение справедливо только в том случае, если общая фосфатаза в цикле намного ниже, чем общая концентрация целевого белка, , т.е. , в пределе ε i « 1. Остальные параметры должны удовлетворять µ i η i ∼ε i . Динамика x i описывается дифференциальным уравнением: (6) со следующим уравнением сохранения, из которого необходимо извлечь y i : (7) x 0  = 78S 91 — нормированный входной сигнал и y n +1  = 0.В уравнении 6, V I = ( K ‘ I μ I η I ) / ( ε k’ ) и V ‘ I = ( ε I K ‘ I ) / ( ε K’ ), где ε ε ‘ — это типичное число, представляющее набор ε I K’ I ( I = 1, … , n ), например среднее арифметическое или геометрическое по этому набору.В уравнении сохранения (уравнение 7) обозначение O ( ε i ) является просто напоминанием о том, что это уравнение записано в низшем порядке в ε i , как и в случае дифференциальное уравнение для x i . В тексте S1 мы обсуждаем улучшение этого уравнения сохранения, которое учитывает первую поправку в ε i . Хотя это расширение не меняет новых свойств, обсуждаемых ниже, его численное интегрирование легко и оно повышает точность аппроксимации.

    Редуцированная система, представленная уравнениями 6–7, в принципе кажется эквивалентной GK-подобной модели, представленной уравнением 4. Однако две основные особенности существенно отличают ее. Во-первых, в нашей новой системе, называемой редуцированной механистической моделью, уравнение сохранения зависит от переменной предыдущего цикла. Во-вторых, что более интересно, знаменатель отрицательного члена в уравнении 6 теперь является функцией следующей переменной y i +1 , в отличие от GK-подобной модели.Эта функция имеет вид эффективного коэффициента Михаэлиса-Ментен ), что является типичным способом обозначения конкурентного ингибирования в кинетике ферментов [22]. В контексте циклов активация-инактивация аналогичный тип уравнения был получен Салазаром и Хёфером при систематическом исследовании одного цикла с учетом конкуренции между киназой и фосфатазой за связывание одного и того же белка-мишени [23].В этом случае эффективный коэффициент Михаэлиса-Ментен появляется также в отрицательном члене уравнения 4, но в форме K’ eff,i  =  (1+ y i /K i ). Однако в нашем исследовании конкуренция индуцируется следующим субстратом y i +1 , и это точно описывает отрицательную обратную связь с цикла i +1 на цикл i : чем выше уровень x i+ 1 , чем меньше y i +1 и, следовательно, тем больше значение отрицательного члена в уравнении 6.Этот модифицированный знаменатель отражает влияние последующего шага на переменные состояния одного заданного цикла. Это не деталь формализма. Это влияет на динамику и свойства сигнального пути, как будет продемонстрировано в следующих разделах. Более того, мы увидим, что, поскольку наша система возникает из контролируемого приближения механистической модели, динамику обеих моделей можно сделать сопоставимой.

    В пределе η i ∼ε i « 1 восстанавливается простой закон сохранения x i + y i ≈1.Однако заметим, что даже в этом пределе и из-за K′ eff,i наша результирующая система не эквивалентна GK-подобной модели. Обратите внимание, что η i ∼ε i « 1 наиболее близко к гипотезе, стоящей за ГК-подобной моделью, где считается, что концентрация целевого белка значительно превышает концентрацию целевого белка. конвертирующие ферменты. В нашем описании конвертирующими ферментами для единицы i являются E’ iT (фосфатаза) и Y i- 1, T (киназа).Принятие предела η i « 1 вместе с тем фактом, что белок-мишень каждого цикла является активирующим белком следующего, приводит к увеличению концентрации белка по мере продвижения каскада. Несмотря на то, что это не является обычным условием для сигнальных каскадов, могут возникнуть примеры, когда этот предел подходит. В качестве возможного релевантного примера, концентрации, зарегистрированные для каскада МАРК, варьируются от 91 277 нМ 91 278 в первом блоке до 91 277 мкМ 91 278 во втором и третьем [8].

    В дополнение к пределу η i ∼ε i « 1 наша схема возмущений охватывает ситуации, когда общий белок не обязательно увеличивается по ходу каскада. Затем мы допускаем η i 1 для всех или для некоторого индекса i до тех пор, пока µ i η i ∼ε i 1 , что приводит к пределу ∼ε i « 1. Поскольку µ i  =  k i /k’ i , этот предел требует, чтобы соответствующая фосфатаза была намного более активной.Однако в этом пределе закон сохранения остается таким, как выражен в уравнении 7, и дальнейшие упрощения невозможны. В результате в этом предельном случае первый член в уравнении 6 зависит от переменной, описывающей предыдущий шаг, другим (и более сложным) образом по сравнению с уравнением 4.

    Наконец, мы замечаем, что наше описание позволяет редуцировать каскадные уравнения со смешанной гипотезой, касающейся ферментативных реакций. Например, мы могли бы иметь μ 1 ~ 1 и η 1 ~ 1 для первого цикла, μ 2 ~ 1 и η 2 ∼ε 2 для второго цикла и т.д.Или даже µ i ∼ε i ½ и η i ∼ε i ½ для всех.

    В тексте S3 мы представляем расширение редуцированной механистической модели для каскада, включающего двойное фосфорилирование. Несмотря на то, что эти уравнения сложнее, чем уравнения 6–7, сохраняется отличительная черта: каждый уровень в каскаде подвержен влиянию следующего уровня, который в соответствующей переменной x i может быть идентифицирован как негативный отзыв.В настоящем исследовании мы анализируем в основном статические свойства этих более сложных уравнений и сравниваем их со свойствами уравнений 6–7, а более исчерпывающая характеристика будет представлена ​​в следующей статье.

    Характеристики новой модели

    В этом разделе мы сообщаем о динамических и статических свойствах новых цепных уравнений (уравнения 6–7) при изучении с помощью численного моделирования и сравниваем их со свойствами предыдущих каскадных моделей. Будем рассматривать как короткие ( n  = 3), так и длинные цепочки ( n  = 10 или 15) соответственно.На всех рисунках мы наносим y i * уровень активного белка, полученный из x i в уравнениях 6–7 (см. текст S4 для сравнения между переменными x i ). и y i * ). В этом разделе каждый параметр в редуцированной механистической модели считается однородным по всей цепи, т. е. , параметры не зависят от индекса и , характеризующего положение того или иного звена в цепи.

    Из предположения об однородности следует, что V i V = µη/ε и V′ i V′  = 1. Параметр K′ выбирается с учетом соотношения K′  =  K/µ . Мы выполнили численное моделирование с другими соотношениями параметров, и свойства, представленные ниже, не сильно зависят от этого выбора.Таким образом, управляющими параметрами являются V , K , µ и η . Поскольку V′  = 1, диапазон интересующих нас значений V лежит около 1. Начальное условие для всех рассмотренных численных симуляций при t = 0 составляет x i  = 0 (и i  = 1) для каждого i .

    Производительность нового приближения.

    На рис. 2 мы представляем начальное исследование динамики, которую может отображать редуцированная механистическая модель, и того, насколько хорошо она приближается к механистической модели.В качестве примера была рассмотрена цепочка из 10 звеньев. На графике изображена временная эволюция переменной, описывающей первую единицу, y 1 * . Для каждого выбора η  =  ε (или µ  =  ε ) выходные данные новой редуцированной механистической модели отображаются пунктирными линиями, а прогнозы механистической модели изображены заштрихованными линиями. Различия между двумя описаниями становятся более заметными по мере увеличения ε , как и ожидалось.Измеряя эти различия с помощью L1-нормы, т. е. сравнивая кривые, вычисляя разницу площадей под этими кривыми, мы находим, что редуцированная модель отклоняется от полной менее чем на 0,5 %, 4,7 % и 10,6 %, для ε 0,01, 0,1 и 0,5 соответственно на фиг.2А. Соответствующие значения процентной разницы на рисунке 2B составляют 0,9%, 8,3% и 18%.

    Рис. 2. Производительность новой модели по сравнению с механической.

    Временная эволюция первой единицы в цепочке из 10 единиц.(A) η = ε = 0,01, 0,1, 0,5 и μ = 1. (b) μ = ε = 0,01, 0,1, 0,5 и η = 1. Другие параметры K  = 0.01, K’  =  K/µ и S  = 1.Штриховые линии: результат новой модели; заполненные строки: вывод полного механистического описания.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000041.g002

    Мы также вычислили ошибки для менее экстремальных условий, таких как 1) ε  = 0.1, η  =  мк  = 0,5; 2) ε  = 0,1, η  = 0,5 и µ  = 1; и 3) ε = 0,1, η = 1 и μ = 0,5 (обратите внимание, что ημ ~2.59 ε для 1) и ημ ~5 ε для как 2) и 3 )). Соответствующие ошибки составляют 4,3%, 3,5% и 5% (данные не показаны). Ошибки прогнозирования стационарных состояний во всех указанных случаях составляют менее 0,0001 %, что свидетельствует о высокой точности редуцированной механистической модели для изучения статических особенностей каскада.Это свойство обусловлено уравнением сохранения (уравнение 7), учитывающим первую поправку в ε i (см. Текст S1).

    Появление затухающих временных колебаний.

    Интересно, что временная эволюция активированного белка, изображенная на рисунке 2, демонстрирует затухающие колебания. Эта особенность отображается как в механистической модели, так и в представленном здесь новом сокращенном описании. Однако такое поведение недостижимо в рамках других доступных описаний моделей сигнальных каскадов, i.е . Уравнения 2 и 4. Наше новое упрощенное описание раскрывает этот атрибут полной (механистической) модели, который оставался (насколько нам известно) скрытым до сих пор.

    Существование затухающих колебаний было подтверждено численным исследованием устойчивости стационарного состояния уравнения 6, которое является устойчивым фокусом. Спектр матрицы Якоби этой системы, рассчитанный в установившемся режиме, действительно имеет несколько собственных значений с ненулевыми мнимыми частями. Однако действительные части всегда отрицательны (как замечено, т.г., продолжением в параметре S ) и поэтому мы не можем получить незатухающие колебания в этой цепочке. Более детальное математическое исследование спектра устойчивости цепи выходит за рамки данной статьи и будет предметом будущих работ. Затухающие колебания невозможны без отрицательной обратной связи между циклами [24] и, таким образом, отражают новую особенность нашей модели каскадов.

    Рисунок 3 содержит репрезентативную характеристику временной динамики модели.Чтобы упростить описание, рассмотрим два параметра управления: μη / ε и η и η , в то время как другие параметры установлены как ε = 0,01, K = 0,01 и K ‘ = К/мк . Входная стимуляция включается в момент времени 0 от S  = 0 до S  =  1. На рисунке 3A показано пространство параметров η V . На каждой панели рисунка 3B нанесена временная эволюция 91 277 y 91 299 i 91 300 90 334 * 90 335 91 278 для трех единиц в цепочке.На некоторых графиках , , , * , демонстрируют затухающие колебания, прежде чем достигнут своего стационарного состояния. Перемещение параметра V вниз по каждой из выбранных кривых, т.е. . с 1,2 до 1, а затем до 0,5, усиливает демпфирование через цепь.

    Рисунок 3. Характеристика временной динамики новой модели.

    (A) Пространство параметров, η по горизонтальной оси, V  =  µη/ε по вертикальной оси (обратите внимание, что оси прерываются).Указаны кривые η  =  ε и µ  =  ε , и выбраны три пары значений ( η , V ) над каждой из них, чтобы показать их поведение При η  =  ε параметр V  =  µ был выбран равным 1,2 (A 1 ), 1,0 (A 2 1 ), 309 , 309 и 0,5 соответственно. Таким же образом, когда µ  =  ε , параметр V  =  η был выбран равным 1.2 (В 1 ), 1,0 (В 2 ) и 0,5 (В 3 ) соответственно. (B) Временная динамика для выбранных пар, изображенных в (A). ε  = 0,01, K  = 0,01, K’  =  K/µ и S  = 1 для всех панелей. Количество звеньев в цепочке n равно 10, за исключением случаев A 3 и B 3 , где показаны оба результата n  = 10 и n  = 3. В каждом случае время отложено в произвольных единицах по горизонтальной оси, и показана временная эволюция y i * для трех единиц в цепочке: y 1 * ( черный), y 4 * (синий) и y 7 * (красный).Для случая N ​​ = 3, тот же цветной шаблон используется для Y 1 , Y 2 и Y 3 3 * соответственно. (C) Стационарное состояние, достигнутое каждым звеном в цепи с n  = 10, нанесенное на график в зависимости от номера звена, для случаев A 1 , A 3 , B 1 и B 3 . Для случаев A 1 , A 3 и B 1 отображаются только результаты в переменной x i .Оба x i и y i * построены для параметров B 3 (штрихпунктирные линии со звездочками и без них соответственно)

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000041.g003

    Усиленные «путевые» колебания.

    Еще одна интересная и удивительная особенность, обнаруженная нашей новой моделью, заключается в том, что, хотя параметры однородны по цепочке, устойчивые состояния переменных y i * не всегда проявляют монотонный тренд по отношению к индекс единицы и .Это свойство видно, например, на рис. 3Б, случай В 3 ( n  = 10), где y 4 * начинает возрастать позже, но достигает более высокого асимптотического значения чем г 1 * . Для дальнейшего изучения этого явления на рисунке 3C мы наносим установившееся значение, достигнутое каждой единицей в цепи с n  = 10, в зависимости от индекса единицы для случаев A 1 , A 3 , B 1 и В 3 .Позиционная организация по всей цепочке — это то, что мы назвали «путь». Таким образом, в этом смысле B 3 иллюстрирует «путевые колебания», которые усиливаются по каскаду. Остальные три примера при детальном рассмотрении демонстрируют аналогичное поведение, но с менее заметным усилением. Обратите внимание, что для этого конкретного рисунка мы нанесли на график переменную 91 277 x 91 299 i 91 300 91 278, чтобы лучше объяснить происхождение колебаний траектории с точки зрения уравнений 6–7. Переменная y i * включена только для случая B 3 (штрихпунктирная линия без символов).Всестороннее объяснение этого явления включено в текст S5.

    Дальнейшая характеристика отрицательной обратной связи между блоками.

    Рассмотрим цепь, находящуюся в равновесии, , т. е. , каскад, в котором каждая единица достигла стационарного состояния. Затем мы возмущаем одну переменную x i , как показано на рис. 4. Природа нашего нового описания, которое связывает каждую единицу как с предыдущей, так и с последующей, позволяет преобразовать локализованное возмущение в обоих направлениях. , вперед и назад.На рисунках 4А и 4В, которые соответствуют параметрам А 3 и В 3 соответственно, показаны случаи, когда распространение происходит в основном вперед или в основном назад. Однако возможно и распространение в обоих направлениях одновременно. Мы видим, что рисунок 4B, где распространение происходит в основном в обратном направлении, имеет более сильную обратную связь, чем рисунок 4A, поскольку K/K’ имеет значение 10 для B и 2 для A.

    Рис. 4. В новой модели боковой ввод распространяется вперед и назад.

    y i * построен как функция индекса звена в цепочке для цепочки из 15 звеньев. Состояние цепи при t = −1 (в условных единицах) обозначено символом + и соответствует стационарной ситуации. При t = 0 указанный блок (см. звездочку на горизонтальной оси) получает возмущение Δ x , которое затем распространяется на другие блоки. Времена от 1 до 10 нанесены пунктирными линиями. Параметры: (A) η  =  ε  = 0.01 и µ  = 0,5, (Б) µ = ε  = 0,01 и η  = 0,5. Остальные параметры: K  = 0,01, K’  =  K/µ и S  = 1 как в (A), так и в (B).

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000041.g004

    Кривые стимул-реакция.

    Теперь мы изучим независимые от времени характеристики нашей модели (уравнения 6–7) и сравним их с характеристиками системы, описываемой уравнением 4, для того же набора параметров.Кривая стимул-реакция определяется, как обычно, стационарными значениями переменных как функция входного стимула S (напомним, что в уравнении 6 x 0  =  S , т.е. считается постоянным во времени). На рисунке 5 показаны кривые стимул-реакция, полученные с помощью уравнения 6 (заштрихованные линии) для условия A 1 из рисунка 3A, за исключением пунктирной линии, которая была рассчитана с помощью GK-подобной модели (уравнение 4). Мы видим, что при заданных параметрах расчеты, выполненные с помощью редуцированной модели, отклоняются менее чем на 0.0001% от (неаппроксимированной) механистической модели. Результаты были получены на примере цепочки из трех звеньев.

    Рисунок 5. Кривые стимул-реакция.

    Кривые стимул-реакция, соответствующие параметрам A 1 на рисунке 3, для цепочки из трех звеньев. Сила стимула равна S , а ответ равен y i * . Переменные, связанные с блоками 1, 2 и 3, показаны черными, синими и красными линиями соответственно.Кривая стимул-реакция y 3 * для GK-подобной модели наложена красными пунктирными линиями.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000041.g005

    На рисунке 5 переменные y i * отображают сигмоидальные отклики. Низкий уровень активации звеньев 1 и 2 обусловлен тем, что белки действительно частично секвестрированы в комплексах фермент-субстрат. Однако y 3 * , не имея возможной секвестрации, достигает гораздо более высокого устойчивого состояния, чем другие единицы, и это устойчивое состояние сравнимо с тем, которое предсказывает GK-подобная модель.Напротив, прогнозы GK-подобной модели для блоков 1 и 2 значительно расходятся с прогнозами нашей новой модели (данные не показаны). y 3 * в ГК-подобной модели реагирует круто из-за характерной сверхчувствительности этой модели. Та же самая переменная, вычисленная с помощью наших уравнений, реагирует менее круто, это несоответствие можно интерпретировать, как это было предложено в работе Blüthgen et. др. [3], тем фактом, что наша аппроксимированная модель, уравнения 6–7, которая дает тот же результат, что и полная система, учитывает явление секвестрации.Эти идеи расширены в следующем разделе.

    Новая модель, примененная к известному пути: сравнение с экспериментальными данными

    В этом разделе мы применяем редуцированную механистическую модель к хорошо известному сигнальному пути, митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) [3], [8]–[10],[25],[26]. Сначала мы основываем наше описание на конкретном опубликованном наборе параметров для этого пути [8]. Важно отметить, что полученные результаты качественно не модифицируются вариациями выбранных значений в диапазонах, предложенных в литературе [8].Более того, они не модифицируются путем выбора различных наборов параметров [9], [25], [26], как описано в тексте S6.

    Хорошо известно, что каскад МАРК состоит из трех уровней, второй и третий включают механизм двойного фосфорилирования. В этом разделе мы рассматриваем как каскад MAPK, так и более простой случай, цепочку из 3 звеньев, где каждое звено представляет собой цикл с 2 состояниями.

    Начиная с опубликованного набора параметров (см. сводку в [8], а также в [10]), мы вычислили параметры, участвующие в сокращенном механистическом описании, и перечислили их в таблице 1.Как описано в тексте S6, существуют дополнительные параметры для случая двойного фосфорилирования, которые обозначены как ν , K * и K″ и принимают значения 1, 0,25 и 0,25. соответственно.

    Согласно табл. 1 условия, при которых редуцированная модель справедлива, выполняются лишь частично: ηµ ε для первого блока и ηµ ∼10 ε для второго и третьего. Даже для этих условий и поскольку основное внимание в этом разделе уделяется стационарным состояниям, упрощенная механистическая модель дает описание, которое отлично согласуется с полной механистической моделью.

    На рисунке 6 мы построили нормализованные кривые стимул-реакция для цепи из 3 звеньев, либо с одинарным фосфорилированием во всех звеньях (A), либо с одинарным фосфорилированием в звене 1 и двойным фосфорилированием в звеньях 2 и 3 (B ), т.е. , случай, соответствующий каскаду MAPK. Оба случая характеризуются параметрами табл. 1. В качестве входного стимула принималась концентрация E 1 T , общее количество киназы для первой единицы каскада (соответствует киназы киназы MAPK в Б). E 1 T , связанный с параметром S , который мы использовали в качестве входных данных в предыдущем разделе, варьировался в широком диапазоне. Результаты были получены как по полной механистической, так и по сокращенной механистической моделям, и результаты неразличимы для масштабов рисунка (черные, синие и красные закрашенные линии для y 1 * , y 2 * и у 3 * соответственно).Для полноты мы также включаем соответствующие результаты, полученные с помощью GK-подобной модели (пунктирные линии).

    Рисунок 6. Кривые стимул-реакция для цепочки из 3 звеньев.

    Кривые стимул-реакция для цепи из 3 звеньев, включающей только одиночное фосфорилирование (А) или двойное фосфорилирование в звеньях 2 и 3, представляющих каскад МАРК (В). Параметры указаны в таблице 1. Ответы были получены как по механистическому, так и по сокращенному механистическому описанию, которые находятся в полном согласии.Входной стимул определяется как E 1 T , общее количество киназы для первой единицы. Y y 1 , y , y 2 , и y 3 * построены с черными, синевыми и красными заполненными линиями соответственно. Также включены прогнозы GK-модели (пунктирные линии). Коэффициенты Хилла, характеризующие каждую кривую, указаны в легенде.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000041.g006

    Для сравнения крутизны откликов мы вычислили кажущийся коэффициент Хилла n H ([8]) для каждой кривой , как указано в легенде. Как и ожидалось, n H увеличивается по цепочке. Более того, n H также значительно сокращается при сравнении предсказаний GK-подобной модели с предсказаниями как механистической, так и редуцированной механистической моделей (которые, как уже упоминалось, неразличимы).Как объяснялось в разделе, посвященном кривым стимул-реакция, эти различия могут быть связаны с тем, что как механистическое, так и упрощенное механистическое описания учитывают «секвестрацию» в ферментативных реакциях [3].

    Мы упомянули, что хорошее согласие между механистическим и редуцированным механистическим описаниями в отношении предсказания стационарных состояний обусловлено законом сохранения (уравнение 7), учитывающим первую поправку в ε i (см. текст S1).Если эту поправку не учитывать, могут появиться различия в стационарных состояниях, предсказываемых механистической моделью и редуцированной механистической моделью. Однако и для параметров на рис. 6 предсказанные значения n H не изменяются при удалении поправки ε i в законе сохранения или даже при удалении η i также поправка ( ie , используя закон сохранения вида x i + y i  = 1).Эти результаты убедительно указывают на надежность новых уравнений в отношении характеристик «сверхчувствительности» каскада.

    На рисунке 6B результаты механистической и редуцированной механистической моделей и соответствующие коэффициенты Хилла восстанавливают опубликованные результаты [8]. Сравнивая рисунки A и B, мы также подтверждаем, что цепь, включающая двойное фосфорилирование, реагирует более круто, чем цепь только с одинарным фосфорилированием, как и ожидалось из предыдущей работы [27].

    На рисунке 7 мы показываем результат стимуляции цепи из 3 звеньев, как показано на схемах рядом с каждой панелью: в качестве входного стимула для каскада была взята концентрация E′ 3 T , общее количество фосфатазы для последней единицы в каскаде (соответствует MAPK в B). E′ 3 T варьировался в предложенном диапазоне вариаций [8]. Увеличение количества фосфатазы приводит к уменьшению кривой ответа y 3 * (красная закрашенная линия), как и ожидалось. Интересно, что наша новая редуцированная модель (уравнения 6–7), а также полное механистическое описание предсказывают, что это возмущение на третьем уровне цепи распространяется в обратном направлении: изменение на самом деле является уменьшением из-за более высокого секвестрации свободных y 2 * на следующем этапе цепочки, вызванного, в свою очередь, увеличением спроса на y 3 .Этот результат демонстрируется обоими каскадами на рисунке 7 (один, включающий только одиночное фосфорилирование, и один с двойным фосфорилированием в единицах 2 и 3), и мы называем это «обратными» кривыми стимул-реакция. Как указывалось ранее, этот результат достигается как при механистическом, так и при сокращенном механистическом описании с реалистичными параметрами, связанными с хорошо изученным сигнальным путем, таким как МАРК.

    Рис. 7. «Обратные» кривые стимул-реакция.

    «Обратные» кривые стимул-реакция для цепи из 3 звеньев, включающей только одно фосфорилирование (А) или с двойным фосфорилированием в звеньях 2 и 3, представляющих каскад МАРК (В).Параметры указаны в таблице 1. Ответы были получены как по механистическому, так и по сокращенному механистическому описанию, которые находятся в полном согласии. Входной стимул задается как E’ 3 T , что является общим количеством фосфатазы для последней единицы. Y y 1 , y , y 2 , и y 3 * построены с черными, синевыми и красными заполненными линиями соответственно.Также включены прогнозы GK-модели (пунктирные линии). На вставках показаны детали рисунков.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000041.g007

    Вставки на обоих рисунках показывают, что для наблюдения этого свойства нет необходимости варьировать параметр E′ 3 T в широких пределах. , скорее, это ясно видно по изменению его только в 5 раз вокруг предполагаемой концентрации (0,12 мкМ ), где наблюдается 20-процентное изменение в достаточно, чтобы быть обнаруженным экспериментально (это означает, что он, скорее всего, не содержится в погрешности эксперимента).Из-за параметров, характеризующих этот конкретный путь, эффект не распространяется на y 1 * (чёрная заштрихованная линия), но этот факт не нужно обобщать (см. Текст S6). Пунктирные горизонтальные линии на рисунках 7A и 7B представляют собой GK-подобный прогноз для кривой отклика y 2 * : в рамках этого феноменологического описания конкретный уровень в каскаде никоим образом не зависит от того, что происходит. в нижестоящем блоке.Однако здесь показано, что это хорошо известное свойство однонаправленного влияния в сигнальной цепи, воплощенное в названии «каскад», не гарантируется в общих сигнальных каскадах.

    В тексте S6 мы расширяем результаты этого раздела, касающиеся «обратных» кривых стимул-реакция для различных наборов опубликованных параметров каскада MAPK.

    Модульный анализ отклика каскада

    Модульный анализ отклика (MRA) [28] применялся для определения сетевой архитектуры каскада в контексте уравнений новой модели (уравнения 6-7).MRA недавно был предложен в качестве инструмента для характеристики взаимодействий между «модулями» в клеточной регуляторной сети, преимущество которого заключается в возможности прямой экспериментальной реализации.

    На самом деле отрицательный знак элемента Якоби ∂x ˙ i /∂x i +1 указывает на то, что каскада оказывает негативное влияние на переменную x i .Этот эффект (то, что мы назвали «отрицательной обратной связью») является внутренним, в отличие от «явной» отрицательной обратной связи, которая иногда рассматривается в моделях сигнальных путей [9], [12], [13]. Таким образом, MRA является подходящим подходом для проверки этой двунаправленной структуры и оценки относительной силы обратного взаимодействия по сравнению с прямым взаимодействием в сигнальном каскаде.

    В результате применения МРА получается матрица местных коэффициентов отклика r .Элемент r ij в этой матрице описывает, как состояние переменной, связанной с модулем j , напрямую влияет на состояние переменной, связанной с модулем i . Точнее, коэффициент отклика r ij меньше/больше 1 означает, что относительное изменение модуля j ослабляется/усиливается в модуле i с коэффициентом r ij ( ie Δ x i /x i  =  r ij Δ x j /x j ).Нулевой коэффициент отклика указывает на отсутствие прямого влияния между задействованными модулями, тогда как отрицательный коэффициент отклика означает ингибирование. Таким образом, матрица обеспечивает карту взаимодействия для характеристики типа и силы взаимодействия между модулями в сотовой регуляторной сети.

    Действительно, если скорость изменения переменной x i обозначить функцией f i , то легко показать, что: вариант матрицы Якоби ∂f i /∂x j (оценка в стационарном состоянии).Кроме того, было доказано, что матрица локального отклика r может быть получена из другой матрицы, называемой матрицей глобального отклика, R p , которая имеет то преимущество, что она доступна экспериментально [28]. Например, элемент ( i , j ) этой матрицы может быть получен путем возмущения параметра p j , влияющего только на модуль j , и вычисления относительных изменений, вызванных устойчивым состоянием x . i , а именно (Δ x i /x i )/ Δ p j . Для получения более подробной информации о широких возможностях метода мы отсылаем читателя к цитируемой ссылке и ссылкам в ней.

    Используя обозначения и концепции из литературы [28], мы применяем метод MRA к каскаду из 3 звеньев, включающему только одиночное фосфорилирование и характеризуемому параметрами в таблице 1 [8]. В этой сети есть три модуля, описанные уравнениями 6-7, каждый из которых соответствует трем последовательным уровням в каскаде и характеризуется одной переменной x i .Рисунок 8A содержит матрицу местных коэффициентов отклика r . Эта матрица была получена прямым вычислением масштабированной матрицы Якоби (уравнение 8) и моделированием экспериментальных возмущений каскада, затем вычислением матрицы глобального отклика, R p , и, наконец, получением r , как описан ранее [28] (детали второго расчета не показаны). Используя MRA, «теоретические» и «экспериментальные» результаты полностью совпали, и результаты показаны на рисунке 8A.

    Рисунок 8. Модульный анализ отклика (MRA).

    Модульный анализ отклика (MRA) применяется к новой модели сигнальных каскадов. MRA был применен к каскаду из 3 единиц, включающему только одно фосфорилирование и характеризуемому параметрами в таблице 1. (A) Карта взаимодействия и реконструированная топология сети относительно переменных x i . (B) Локальные коэффициенты отклика (относительно x i ) по сравнению с параметром E 1 T .Черный, синий, красный и зеленый для r 12 , r 21 , r 23 и r 032 , соответственно. Звездочками над каждой кривой отмечены значения матрицы в (A), соответствующие E 1 T  = 3×10 4 мкМ мкМ. (C) Карта взаимодействия и реконструированная топология сети относительно переменных y i * .

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000041.g008

    Структура матрицы r трехдиагональна, что означает, что первый уровень в каскаде не влияет напрямую на третий ( ​​ r 31  = 0), и наоборот ( r 13  = 0). Коэффициенты r 21 и r 32 положительны и отражают положительное влияние каждого уровня в каскаде на последующий.Интересно, что r 12 и r 23 оба являются отрицательными, указывая на ингибирующий эффект от единицы ( i +1) к единице i . Результирующие соединения между блоками каскада представлены на схеме на рис. 8А.

    Чтобы лучше понять эти результаты, мы изучили, как коэффициенты в матрице на рисунке 8А зависят от параметров, характеризующих каскад. Например, рисунок 8b показывает коэффициенты R 21 , R 3297 R R 12 и R 23 против параметра E 1 T . R R R и R R 13 Zero (данные не показаны), R 21 и R 32 — это положительный, а R 12 и R 23 отрицательные во всем диапазоне, где варьировались E 1 T . В зависимости от значения E 1 T каждый из ненулевых r ij может быть меньше или больше 1, а относительная сила обратной и прямой связи для данной пары модулей, e .грамм. | r 12 /r 21 | могут иметь большие вариации. Аналогичные кривые приводились в литературе для сигнальных каскадов [29], но не содержали информации о r 12 и r 23 , которые в предыдущих работах всегда считались нулевыми.

    Исследования, подобные представленному на рисунке 8B, помогают нам понять, а также предсказать степень обратной связи в зависимости от параметров модели.Одной из полезных функций этой работы является отправная точка более систематического исследования того, как усилить или ослабить эту связь в каскаде, что является предметом нашей текущей работы.

    Интересно, что карта взаимодействия, характеризующая связи между переменными x i (матрица r ( x i ) на рисунке 8A), показывает сильные различия по сравнению с картой, рассчитанной для «свободных» ферментных переменных. y i * (матрица r ( y i * ) на рисунке 8C.Хотя явная система дифференциальных уравнений для переменных y i * не написана, матрица r ( y i * ) может быть рассчитана описанным «экспериментальным» методом. в литературе [28]. Результат на рисунке 8C представляет собой среднее значение четырех выходных данных, и соответствующая ошибка (стандартная ошибка среднего значения) составляет менее 4%. Как указано в реконструированной топологии, близко к матрице, R 12 и R R 23 теперь положительны (как R 21 и R 32 ), R 31 равен нулю, а R 13 отрицательный, указывающий ингибирующую связь от переменной y 3 на переменную Y 1 * .Матрица r ( y i * ) согласуется с результатами на рисунке 7A (а также с результатами в тексте S6): другими словами, ответ в y 2 * идет в том же направлении, что и один в y 3 (в то время как x 3 3 и увеличение x 2 , данные не показаны).

    В настоящее время в литературе доступны экспериментальные данные по применению МРА к каскаду МАПК [30], показывающие ненулевые r 21 и r 32 коэффициенты (а также ненулевые r

    3 01 01 и р 13 коэффициенты). Интерпретация ненулевых r 31 и r 13 была предложена в терминах обычных «явных» положительных или отрицательных обратных связей, которые иногда учитываются в моделях сигнальных путей [9],[12],[ 13].С этой точки зрения, объяснение ненулевых коэффициентов r 12 и r 23 было, по крайней мере, относительно r 23 и основано на экспериментальных данных, что не только , в состоянии фосфорилат Y y 3 3 3 может фосфорилат y 2 [30], [31]. Наши результаты, однако, предполагают, что неисчезающие обратные коэффициенты ( r 12 , r 13 , r 23 ) могут быть объяснены, по крайней мере частично, естественной «неявной» обратной связью. может существовать в сигнальном каскаде.Количественная корреляция между этими недавними экспериментальными результатами и нашими предсказаниями в настоящее время невозможна. В опубликованных экспериментах каскад МАРК не изолирован, а встроен в сложный клеточный механизм; следовательно, измеренные связи могут включать белки, внешние по отношению к самому каскаду, и было бы преждевременно устанавливать связь с нашей упрощенной моделью. Тем не менее, работа в [30] предлагает направление для экспериментов, которые могли бы подтвердить наши результаты.

    Обсуждение

    Основной вклад этой работы состоит в том, чтобы предложить новую модель с одной переменной на цикл для сигнальных каскадов циклов ковалентной модификации, согласующуюся с полным механистическим описанием. Наша модель раскрывает новые и биологически значимые свойства таких каскадов. Эти свойства полностью характерны для случая однофосфорилированных каскадов. Кроме того, случаи одинарного и двойного фосфорилирования сравниваются в отношении их кривых стимул-реакция, а более исчерпывающая характеристика схемы, включающей двойное фосфорилирование, будет представлена ​​в будущей статье.

    Схема на рис. 1, которая использовалась многими группами, наводит на мысль о концепции «каскада». С системной точки зрения каскад представляет собой систему, состоящую из звеньев, выход которых последовательно является входом для следующего звена. Основываясь на этой структуре, мощные концепции теории управления могут быть успешно применены к изучению сигнальных каскадов [14]. Хотя эти концепции доказали свою полезность во многих контекстах, такого рода схематическое представление неявно передает идею о том, что сигнальный каскад — это всего лишь цепочка с прямой связью, в которой передача сигнала аналогична эффекту домино [32], [33].Наше исследование проливает на эту систему иной свет, показывая, что такое схематическое изображение может вводить в заблуждение, поскольку оказывается, что каждое звено на самом деле связано не только со следующим, но и с предыдущим, и из этих взаимодействий может возникнуть интересная динамика. .

    Нашей первоначальной мотивацией для разработки нового описания сигнальных каскадов с одной переменной было следующее наблюдение. Основное предположение, лежащее в основе ГК описания одиночного цикла, состоит в том, что концентрация целевого белка значительно превышает концентрацию конвертирующих ферментов.Сохранение того же предположения в отношении каскада единиц означало бы, что целевые белки находятся во все более и более высокой концентрации по мере развития каскада, поскольку они действуют как трансформирующий фермент для следующего цикла. Насколько нам известно, этот важный вопрос не упоминался в литературе, за исключением краткого комментария в работе Millat et. др. ([20], стр. 11).

    Чтобы лучше понять этот вопрос, мы искали специальные предельные случаи, для которых механистическая и GK-подобная модели хорошо согласуются.Однако оказывается, что динамика сигнального каскада, описываемая механистической и ГК-подобной моделями, не может быть последовательно сопоставлена. Фундаментальная причина этого несоответствия заключается в том, что тщательный анализ возмущений, примененный к механистической модели, дает другой набор уравнений.

    Отметим, что в поисках адекватного набора гипотез, ведущих от механистических уравнений к модели, заданной уравнениями 4, мы изучили альтернативную схему, в которой модифицированный белок Y i * не является непосредственно киназой следующей реакции.Вместо этого мы изучили случай, когда Y i * активирует эту киназу. Эта схема была предложена в работе Гольдбетера [12]. Полученное уравнение (см. текст S7) принципиально отличается от модели, подобной GK. В действительности никакой набор допущений не может привести к модели, подобной GK, как к предельному случаю нашей модели.

    Наш математический метод основан на стандартном предположении о квазистационарном состоянии (QSSA), которое можно применять при четко определенных условиях, чтобы выявить четкое разделение между медленной и быстрой динамикой механистической модели.Согласно этой стандартной схеме QSSA, наш анализ показывает, что хорошая медленная переменная, для которой могут быть написаны уравнения эволюции, представляет собой сумму свободного активированного фермента, который доступен в цикле i th , плюс количество этого белка, который захвачен к следующему циклу межконверсионного преобразования. Идею работы со смешанной переменной 91 277 x 91 299 i 91 300 91 278 можно дополнительно обобщить, рассматривая «суммарную» переменную, соответствующую общему количеству активированного фермента, находящегося не только в виде свободных молекул или связанных со следующим субстратом, но и в комплексе с ним. обратный фермент E’ i .Фактически, этот выбор является ключевым компонентом метода, называемого «полным» приближением квазистационарного состояния (tQSSA), который, как было доказано, является простым, но наиболее эффективным расширением стандартного QSSA [34]. Применение этой расширенной структуры к описанию сигнального каскада на рисунке 1 связано с нашим текущим исследованием. В том же контексте другие авторы недавно применили метод tQSSA для изучения малых сетей циклов GK [35]. Эти системы не образуют каскадов, а предполагают более сложную связь между блоками.Тем не менее их результаты показывают, что метод tQSSA действительно успешно позволяет получить сокращенный набор уравнений с одной переменной на цикл, который точно воспроизводит динамику сети для большого диапазона параметров системы.

    Даже в менее расширенной структуре QSSA четко прописаны условия, при которых модель действительна. В таких условиях наша новая модель действительно полностью согласуется с полной механистической моделью (рис. 2). Эти условия выражены в терминах трех ключевых параметров (уравнение 5), которые мы определили для упрощения исследования.Несмотря на то, что феноменологические уравнения (уравнение 4) привлекательны из-за их более простой формы и модульной природы, мы не смогли найти никакого набора допущений, которые позволили бы нам восстановить эти описания. Наша упрощенная модель выявляет свойства сигнальных каскадов, которые либо были скрыты сложной структурой полной механистической модели, либо терялись в упрощенных феноменологических описаниях.

    Было установлено, что редуцированная механистическая модель справедлива, когда выполняются эти два условия: ε i « 1 и µ i η i ∼ε i .Изучение характеристик новой аппроксимации (рисунок 2 и соответствующие вычисленные ошибки) показывает, что даже когда эти условия выполняются лишь умеренно, новая модель по-прежнему устойчива в аппроксимации полного описания. Например, мы вычислили 5%-ную ошибку для ε  = 0,1, η  = 1 и µ  = 0,5 (что означает µη∼ 5 8 ε 9). Более того, мы заметили, что прогнозы установившегося состояния редуцированной модели очень точны.Таким образом, свойства сигнальных каскадов, которые мы раскрываем благодаря новой редуцированной модели, не ограничены жесткой зависимостью между концентрациями и скоростями реакции, которую трудно достичь в условиях in vivo или in vitro .

    Все новые свойства сигнального каскада, о которых сообщается в этой статье, связаны, как упоминалось ранее, с отрицательной обратной связью от каждой единицы к предыдущей. Эта обратная отрицательная обратная связь может вызывать затухающие временные колебания в цепи или усиливать «путевые» колебания в устойчивых состояниях каскада.Интересно, что он также может преобразовывать сигнал как вперед, так и назад. Учитывая разветвленную сложную природу многих путей передачи сигнала, это открытие может иметь широкое значение и может помочь сфокусировать дальнейшие экспериментальные исследования.

    Недавно сообщалось, что 3-уровневый каскад МАПК имеет автономные колебания без какой-либо дополнительной явной обратной связи [36]. После систематического численного исследования соответствующей механистической модели [8] авторы дают качественное описание механизма, ответственного за эти незатухающие колебания.Их объяснение настоятельно предполагает необходимость бистабильного поведения на втором или третьем уровнях каскада, что требует двойного фосфорилирования на этих стадиях [37]. В соответствии с их выводами мы наблюдали только затухающие колебания в динамике каскада одиночного фосфорилирования (уравнения 6–7), который был в центре внимания настоящей работы. Интересно, что предварительное численное моделирование нашей уменьшенной каскадной модели с двойным фосфорилированием (текст S3) показывает, что эти автономные колебания восстанавливаются в упрощенном описании.

    Были также исследованы кривые стимул-реакция новой модели (рис. 5). Они имеют обычную сигмоидальную форму, характерную для сверхчувствительных ответов; однако они демонстрируют меньшую крутизну по сравнению с выходом GK-подобной модели. Этот результат подтверждает выводы, сделанные в работе Blüthgen et al. [3], где был проведен анализ эффекта секвестрации. Этот эффект частично смягчается двойным фосфорилированием (рис. 6), как и ожидалось из литературы [27].

    Чтобы дополнительно охарактеризовать новую модель в реалистичных условиях, мы изучили ее с учетом различных наборов опубликованных параметров, соответствующих хорошо известному сигнальному пути, такому как MAPK (рис. 6 и 7 и текст S6). Мы обнаружили, что способность модели преобразовывать сигнал как в прямом, так и в обратном направлении широко распространена и что этот эффект имеет достаточную величину для экспериментальной проверки.

    Наконец, мы применили модульный анализ отклика, чтобы определить сетевую архитектуру каскада, описываемую уравнениями новой модели (рис. 8).Этот известный подход позволяет не только протестировать двунаправленную структуру каскада, но и оценить относительную силу обратного взаимодействия.

    Таким образом, наши результаты никоим образом не снижают важность предыдущих моделей, таких как GK-подобные модели и модели с линейными скоростями. Напротив, результаты нашей модели обеспечивают другой подход к простой модели с одной переменной на цикл для описания сигнальных каскадов. Мы надеемся, что наш вклад поможет в понимании существующих моделей сигнальных каскадов, улучшит описание имеющихся данных и вдохновит как на теоретические, так и на экспериментальные исследования.

    Methods

    Все ODE были интегрированы в MATLAB 7 (Mathworks, Natick, MA). Кривые стимул-реакция были получены с использованием MATCONT, пакета MATLAB для численного бифуркационного анализа ОДУ. Символьные вычисления были выполнены с использованием Symbolic Math Toolbox в MATLAB.

    Благодарности

    Мы хотели бы поблагодарить редакторов и рецензентов, которые помогли нам улучшить статью.

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: ACV J-AS.Проанализированы данные: ACV J-AS. Написал статью: ACV J-AS SDM.

    Каталожные номера

    1. 1. Альбертс Б., Джонсон А., Льюис Дж., Рафф М., Робертс К. и др. (2001) Молекулярная биология клетки. Четвертое издание. Гарланд Наука.
    2. 2. Холоденко Б.Н. (2006) Динамика клеточных сигналов во времени и пространстве. Nat Rev Mol Cell Biol 7: 165–176.
    3. 3. Блютген Н., Брюггеман Ф.Дж., Легеви С., Герцель Х., Вестерхофф Х.В. и др. (2006)Влияние секвестрации на каскады передачи сигнала.FEBS J 237: 895–906.
    4. 4. Ortega F, Acerenza L, Westerhoff HV, Mas F, Cascante M (2002) Зависимость от продукта и бифункциональность ставят под угрозу сверхчувствительность каскадов передачи сигнала. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 1170–1175.
    5. 5. Thattai M, van Oudenaarden A (2002)Ослабление шума в сверхчувствительных сигнальных каскадах. Биофиз J 82: 2943–2950.
    6. 6. Сауро Х.М., Холоденко Б.Н. (2004) Количественный анализ сигнальных сетей.Прог Биофиз Мол Биол 86: 5–43.
    7. 7. Hornberg JJ, Bruggeman FJ, Westerhoff HV, Lankelma J (2006) Рак: болезнь системной биологии. Биосистемы 83: 81–90.
    8. 8. Huang CY, Ferrell JE Jr (1996)Сверхчувствительность в митоген-активируемом каскаде протеинкиназ. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 10078–10083.
    9. 9. Холоденко Б.Н. (2000) Отрицательная обратная связь и сверхчувствительность могут вызывать колебания в митоген-активируемых протеинкиназных каскадах.Eur J Biochem 267: 1583–1588.
    10. 10. Blüthgen N, Herzel H (2003)Насколько надежны переключатели во внутриклеточных сигнальных каскадах? J Theor Biol 225: 293–300.
    11. 11. Goldbeter A, Koshland DE Jr (1981)Усиленная чувствительность, возникающая в результате ковалентной модификации в биологических системах. Proc Natl Acad Sci U S A 78: 6840–6844.
    12. 12. Goldbeter A (1991) Минимальная каскадная модель митотического осциллятора с участием циклина и киназы cdc2.Proc Natl Acad Sci U S A 88: 9107–9111.
    13. 13. Игошин О.А., Голдбитер А., Кайзер Д., Остер Г. (2004) Биохимический осциллятор объясняет некоторые аспекты поведения Myxococcu s xanthu s во время развития. Proc Natl Acad Sci USA 101: 15760–15765.
    14. 14. Анджели Д., Феррелл Дж. Э. Младший, Зонтаг Э. Д. (2004) Обнаружение мультистабильности, бифуркаций и гистерезиса в большом классе биологических систем с положительной обратной связью. Proc Natl Acad Sci USA 101: 1822–1827.
    15. 15. Волкенхауэр О., Улла М., Велстед П., Чо К.Х. (2005)Системный и сигнальный подход к внутриклеточной динамике. Biochem Soc Trans 33: 507–515.
    16. 16. Csiksz-Nagy A, Kapuy O, Gyorffy B, Tyson JJ, Novk B (2007)Моделирование сети инициации разделения (SIN) в делящихся дрожжевых клетках. Курр Жене 51: 245–255.
    17. 17. Генрих Р., Нил Б.Г., Рапопорт Т.А. (2002)Математические модели передачи сигнала протеинкиназы. Мол Ячейка 9: 957–970.
    18. 18. Nakabayashi J, Sasaki A (2005)Оптимальный номер шага фосфорилирования внутриклеточного пути передачи сигнала. Теория биологии 233: 413–421.
    19. 19. Марл М., Грубельник В. (2007) Роль каскадов в преобразовании колебательных сигналов в стационарные ступенчатые ответы. Биосистемы 87: 58–67.
    20. 20. Миллат Т., Буллингер Э., Ровер Дж., Волкенхауэр О. (2006) Приближения и их последствия для динамического моделирования путей передачи сигнала.Math Biosci 207: 40–57.
    21. 21. Legewie S, Schoeberl B, Blüthgen N, Herzel H (2007) Конкурирующие стыковочные взаимодействия могут привести к бистабильности в каскаде MAPK. Биофиз Дж. 93: 2279–2288.
    22. 22. Клеланд В.В. (1963) Кинетика катализируемых ферментами реакций с двумя или более субстратами или продуктами II. Ингибирование: номенклатура и теория. Биохим. Биофиз. Акт 67: 173–187.
    23. 23. Salazar C, Höfer T (2006)Кинетические модели циклов фосфорилирования: систематический подход с использованием приближения быстрого равновесия для белок-белковых взаимодействий.Биосистемы 83: 195–206.
    24. 24. Gouzé JL (1998) Положительные и отрицательные схемы в динамических системах. J Биол Системы 6: 11-15.
    25. 25. Бхалла США, Айенгар Р. (1999) Возникающие свойства сетей биологических сигнальных путей. Наука 283: 381–387.
    26. 26. Левченко А., Брук Дж., Штернберг П.В. (2000) Каркасные белки могут двухфазно влиять на уровни передачи сигналов митоген-активируемой протеинкиназы и снижать ее пороговые свойства.Proc Natl Acad Sci U S A 97: 5818–5823.
    27. 27. Феррелл Дж. Э. Младший (1996) Фантастическое срабатывание переключателя: как каскад протеинкиназ может преобразовывать градуированные входы в переключаемые выходы. Trends Biochem Sci 21: 460–466.
    28. 28. Холоденко Б.Н., Кияткин А., Брюггеман Ф.Дж., Зонтаг Э., Вестерхофф Х.В. и др. (2002) Распутывая провода: стратегия отслеживания функциональных взаимодействий в сигнальных и генных сетях. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 12841–12846.
    29. 29.Холоденко Б.Н., Хук Дж.Б., Вестерхофф Х.В., Браун Г.К. (1997) Количественная оценка передачи информации через пути передачи клеточного сигнала. FEBS Lett 414: 430–434.
    30. 30. Santos SD, Verveer PJ, Bastiaens PI (2007)Топология сети MAPK, индуцированная фактором роста, формирует ответ Erk, определяющий судьбу клеток PC-12. Nat Cell Biol 9: 324–330.
    31. 31. Холоденко Б.Н. (2007) Распутывание сигнальных проводов. Nat Cell Biol 9: 247–249.
    32. 32. Гонзе Д., Голдбитер А. (2000) Модель сети циклов фосфорилирования + дефосфорилирования, отображающая динамику домино и часов.J Theor Biol 210: 167–186.
    33. 33. Мюррей А.В., Киршнер М.В. (1989) Домино и часы: объединение двух взглядов на клеточный цикл. Наука 246: 614–621.
    34. 34. Борганс Дж. А., Де Бур Р. Дж., Сегель Л. А. (1996) Расширение приближения квазистационарного состояния путем замены переменных. Bull Math Biol 58: 43–63.
    35. 35. Чилиберто А., Капуани Ф., Тайсон Дж. Дж. (2007) Моделирование сетей связанных ферментативных реакций с использованием приближения полного квазистационарного состояния.PloS Comput Biol 3: 463–472.
    36. 36. Qiao L, Nachbar RB, Kevrekidis IG, Shvartsman SY (2007)Бистабильность и колебания в модели Хуанга-Феррелла передачи сигналов MAPK. PLoS Comput Biol 3: 1819–1826.
    37. 37. Маркевич Н.И., Хоек Ю.Б., Холоденко Б.Н. (2004) Переключение сигналов и бистабильность, возникающие в результате мультисайтового фосфорилирования в каскадах протеинкиназ. J Cell Biol 164: 353–359.

    IκBε обеспечивает отрицательную обратную связь для контроля колебаний NF-κB, динамики передачи сигналов и экспрессии воспалительных генов | Журнал клеточной биологии

    Мы использовали компьютерную модель для определения условий, при которых экспрессия IκBε, реагирующая на NF-κB, будет опосредовать отрицательную обратную связь на индуцированную стимулом активность NF-κB, и обнаружили, что наиболее значительная роль IκBε была в системах с пониженным IκBα.Чтобы смоделировать такие условия, мы использовали компьютерное моделирование для изучения временного профиля ядерного NF-κB в ответ на 15-минутную стимуляцию в системах, в которых отсутствует IκBα, -ε или оба (рис. 4A). Системы, содержащие все три IκB, обнаруживают быструю ядерную локализацию NF-κB с последующим удалением из ядра в течение 1 ч, как показано ранее (Hoffmann et al., 2002). Однако в системах, в которых отсутствует IκBα, мы предсказали эффективное подавление активности NF-κB в течение третьего часа и далее. В этом контексте дефицит IκBε приводит к пролонгированной активности NF-κB, тогда как в системах, содержащих высокую экспрессию IκBα, он не оказывает влияния.

    Мы использовали IκBα-дефицитные MEF в качестве модели типов клеток со сниженной экспрессией IκBα. Эти MEF показали активность NF-κB в течение примерно 3 часов в ответ на 15-минутную переходную стимуляцию TNF, после чего она резко ослаблялась (рис. 4B). Напротив, клетки с дефицитом как IκBα, так и -ε показали выраженную задержку ослабления, при этом NF-κB все еще присутствовал в ядре даже через 6 часов. Клетки дикого типа и IκBε-дефицитные почти неразличимы, и у обоих наблюдается сильное накопление NF-κB через 30 минут и ослабление в течение 1 часа.В совокупности эти данные убедительно свидетельствуют о том, что IκBε отвечает за удаление NF-κB из ядра в поздние моменты времени, обеспечивая динамическое функциональное взаимодействие с более быстрой обратной связью IκBα.

    Было показано, что временной контроль локализации NF-κB с помощью IκBα контролирует экспрессию гена, чувствительного к NF-κB, не только количественно (Nelson et al., 2004), но и качественно (Hoffmann et al., 2002). Чтобы изучить влияние IκBε-отрицательной обратной связи на экспрессию NF-κB-зависимых генов, транскрипцию пяти NF-κB-чувствительных генов отслеживали с помощью RPA после временной стимуляции TNF у дикого типа, i κ b α / и i κ b α / i κ b ε

    5 ячеекГены, кодирующие TNF, G-CSF и LIF, индуцибельно экспрессируются в фибробластах при стимуляции TNF, но уровни мРНК возвращаются к исходному уровню в течение 3 часов в клетках дикого типа. В IκBα-дефицитных клетках эти гены аттенуируются в течение 4 ч (рис. 4С). В этом контексте потеря IκBε-отрицательной обратной связи приводит к дальнейшей задержке ослабления и количественной дерегуляции экспрессии TNF, G-CSF и LIF. Интересно, что потеря как IκBα-, так и -ε-отрицательной обратной связи имеет драматический качественный эффект для GM-CSF и MIP-2.Хотя эти гены не индуцируются в клетках дикого типа или IκBα-дефицитных клетках, оба сильно реагируют на активацию NF-κB, когда отсутствуют как IκBα-, так и -ε-отрицательные обратные связи. Представленные данные демонстрируют, что IκBε-зависимая отрицательная обратная связь регулирует терминацию экспрессии NF-κB-чувствительных генов как в количественном (в случае TNF, G-CSF и LIF), так и качественном (в случае GM-CSF) и MIP-2).

    Функциональное взаимодействие между антифазными IκBα- и -ε-отрицательными реакциями обратной связи может объяснить различия в профилях экспрессии генов, зависимых от NF-κB, наблюдаемых в различных типах клеток.В MEF опосредованная IκBε отрицательная обратная связь, по-видимому, является вторичной по отношению к той, что обеспечивается IκBα в ответ на преходящие воспалительные стимулы, и поэтому предполагается, что IκBα контролирует большую часть экспрессии гена, отвечающего за NF-κB (Ghosh et al., 1998). ). Однако соотношение содержания IκBε по отношению к IκBα зависит от типа клеток (Memet et al., 1999; Spiecker et al., 2000; Emmerich et al., 2003; Doerre et al., 2005), что позволяет предположить, что IκBε может играть преобладающую роль в экспрессии гена, чувствительного к NF-κB, в определенных типах клеток.Действительно, исследования in vivo показали, что дефицит функционального IκBε имеет физиологические последствия (Memet et al., 1999; Spiecker et al., 2000; Emmerich et al., 2003; Doerre et al., 2005) и, таким образом, подчеркивает представление о том, что ни одна изоформа IκB не функционирует сама по себе. Чтобы понять регуляцию активности NF-κB в разных типах клеток и в ответ на различные стимулы, необходимо учитывать взаимодействие всех изоформ IκB в сигнальном модуле IKK–IκB–NF-κB.

    Наши исследования были направлены на количественную характеристику временных профилей экспрессии трех изоформ IκB и изучение их функциональных последствий для регуляции NF-κB.Более ранние исследования показали индуцируемую экспрессию IκBε (Simeonidis et al., 1997; Whiteside et al., 1997). Мы продемонстрировали, что индукция IκBε зависит от NF-κB и функционирует, чтобы ослабить активность NF-κB и прекратить экспрессию гена, чувствительного к NF-κB. На основании этих трех критериев мы заключаем, что IκBε опосредует добросовестную функциональную регуляцию с отрицательной обратной связью активности NF-κB. Важно отметить, что наши исследования показывают, что индуцируемая экспрессия IκBε задерживается на 45 минут по сравнению с экспрессией IκBα, таким образом, создавая регуляторный модуль с двумя отрицательными обратными связями, который критически контролирует динамику активности NF-κB.Мы предполагаем, что относительная сила двух механизмов обратной связи и их временная взаимосвязь друг с другом могут объяснить динамическую регуляцию активности NF-κB в зависимости от типа клеток.

    Контроль обратной связи передачи сигналов Wnt на основе сверхстабильной коагрегации гистидиновых кластеров между Naked/NKD и Axin

    […] Рукопись представляет собой значительный вклад в эту область и хорошо вписывается в тематику журнала. Серьезных экспериментальных проблем нет.Мы предлагаем авторам удалить данные p62, поскольку они кажутся плохо интегрированными. Авторы должны обратиться к комментариям ниже.

    Мы бы предпочли сохранить данные p62 как часть нашего исследования, потому что эти данные надежны и поразительны: p62 и NBR1 были лучшими совпадениями в нашем скрининге BioID и, кроме Axin, единственными совпадениями, сильно зависимыми от HisC (рис. 8Б). Кроме того, существует выраженное предпочтение p62 взаимодействовать с агрегированными NKD1 по сравнению с низкомолекулярными (рис. 8C, D), что согласуется с общим представлением о том, что аутофагия имеет тенденцию нацеливаться на агрегированные белки (например,грамм. Ма и др., 2015). И последнее, но не менее важное: наши данные о p62 в значительной степени согласуются с предыдущей работой группы Chen, показывающей, что Disheveled подвергается деградации посредством аутофагии путем взаимодействия с p62 и GABARAP (Gao et al., 2010; Zhang et al., 2011). Данные p62 позволяют нам предположить аутофагию как путь для Naked/NKD-зависимой деградации сигналосом Wnt во время длительной передачи сигналов Wnt, что, как мы надеемся, будет стимулировать дальнейшую работу по закреплению этого представления.

    — Авторы могли бы более критически обсудить, какие были предоставлены доказательства того, что HMW-кластеры His-C образуются в клетках или у дрозофилы в условиях отсутствия сверхэкспрессии.

    Это можно окончательно установить только с помощью антител, достаточно чувствительных для обнаружения эндогенных белков Naked/NKD, но, к сожалению, они недоступны. Теперь мы прямо заявляем об этом в последнем абзаце подраздела «Nkd1 HisC имеет решающее значение для образования тройного комплекса с Axin и DVL2».

    – Есть ли у дрозофилы Axn аналогичный аминокислотный кластер His-C, который еще больше поддерживает модель авторов? Если нет, что бы это значило для потребности в агрегатах His-C для передачи сигналов?

    Хорошая мысль! Надо было посмотреть на это раньше: оказывается, Drosophila Axin не имеет гистидинового кластера.На самом деле гистидиновые кластеры кажутся несколько неоднородными среди аксинов беспозвоночных (и не всегда присутствуют и в белках NKD беспозвоночных, как показано на рисунке 1 — дополнение к рисунку 1). Поэтому мы вставили следующий абзац в наше обсуждение:

    «Наши предварительные поиски показали, что гистидиновые кластеры в белках NKD и Axin полностью консервативны у позвоночных, однако их появление среди беспозвоночных более неоднородно. […] Таким образом, возможно, что некоторые белки NKD беспозвоночных (i) используют другой механизм для совместной кластеризации с Axin, (ii) не образуют кластеров для ассоциации с Axin или (iii) вообще не связываются с Axin.Будет интересно изучить это в будущих исследованиях».

    — Введение очень длинное, и его можно было бы сократить. Было бы полезно, если бы авторы включили другие точки зрения (либо во Введение, либо в Обсуждение) о значимости высокомолекулярных комплексов Dvl.

    Мы согласны, особенно длинный четвертый абзац, подробно описывающий различные функции NKD в развитии различных позвоночных. Поскольку это имеет лишь ограниченное отношение к нашему исследованию, мы существенно сократили этот абзац (см. пересмотренное введение).

    Мы не совсем уверены, что подразумевается под предложением «включить другие точки зрения на значимость высокомолекулярных комплексов Dvl», но предполагаем, что это относится к размеру эндогенных сигналосом Disheveled. Поэтому мы вставили предложение в пересмотренное введение (второй абзац), чтобы заявить, что эндогенные сигналосомы возникают в результате ограниченной полимеризации Disheveled, ссылаясь на два недавних исследования изображений (из лабораторий Вейса и Киршнера), которые были опубликованы примерно во время подачи нашей рукописи. (Кан и др., 2020, и Ма и др., 2020).

    – Ma et al., 2020 (лаборатория Киршнера) следует обсудить и процитировать недавние результаты исследований динамики малых молекул Disheveled

    Готово (см. пункт выше). Тем не менее, мы не считаем целесообразным включать подробное обсуждение размера эндогенных сигналосом Wnt, поскольку это не имеет прямого отношения к нашему исследованию (отметим также, что ни одно из упомянутых выше исследований визуализации не рассматривало сигналосомы Wnt после продолжительной стимуляции Wnt, т.е. в условиях, когда Naked/NKD объединяется с Axin).

    – В реферате «эпителиальные клетки, чей HisC был удален»: было бы яснее, если бы авторы добавили NKD перед HisC.

    Выполнено (см. пересмотренный Реферат).

    — Авторы заявляют, что «Таким образом, Nkd1, по-видимому, нацелен на аксин-содержащие сигналосомы Wnt посредством одновременного связывания с DVL и HisC-зависимой коагрегации с аксином». Откуда мы знаем, что это сигналосомы, а не несвязанные Axin или Dsh? Мы предлагаем смягчить это утверждение.

    Мы перефразировали это предложение, чтобы прояснить, что это всего лишь одно предположение, согласующееся с данными (подраздел «Nkd1 HisC имеет решающее значение для образования тройного комплекса с Axin и DVL2»).

    — пятно на рисунке 4B, указывающее на HMW NKD, имеет низкое качество. Можно ли переделать? Или, возможно, есть другая доступная экспозиция?

    Спасибо, что указали на это: к сожалению, изображение этого пятна случайно растянулось во время подготовки рисунка, и поэтому кластеры HMW Nkd1 выглядели «смазанными».Теперь мы исправили это (см. пересмотренный рисунок 4B).

    – Когда в «Результатах» авторы обсуждают мутанты DVL2-GFP, причина этих конкретных мутаций неясна. Уточняющее заявление поможет сделать рукопись удобочитаемой.

    Эти мутанты использовались для проверки того, необходима ли полимеризация или димеризация Disheveled для стимуляции агрегации Nkd1, что мы сейчас указываем во вступительном предложении нового абзаца, посвященного этим вопросам (подраздел «Disheveled способствует совместной агрегации между Nkd1 и Axin1» , второй абзац.

    — Некоторые фигуры представлены не по порядку. Например, рисунок 1 — дополнение к рисунку 2 упоминается в тексте перед рисунком 1 — дополнение к рисунку 1.

    Это не так: мы обращаемся к рисунку 1 (дополнение к рисунку 1 во введении) до нашего первого обращения к рисунку 1 (дополнение к рисунку 2 в результатах). Мы также дважды проверили, чтобы все остальные рисунки (и панели) цитировались по порядку в основном тексте.

    – Иммуноблоты должны иметь маркеры молекулярной массы и должны быть обрезаны так, чтобы сверху и снизу оставалось пространство шириной 5 полос.

    Мы добавили маркеры молекулярной массы к наиболее важному первому пятну, показывающему LMW и HMW Nkd1 (рис. 1C), которые затем применяются ко всем последующим пятнам, которые мы обрезали, чтобы показать только срезы, содержащие соответствующие полосы. Помечать все эти срезы одним маркером (ни на одном) кажется несколько бессмысленным, а увеличение их ширины (в 2-3 раза, как предлагается) сделало бы большинство наших фигур довольно большими и громоздкими. Вместо этого мы предлагаем поместить все необрезанные исходные пятна в качестве дополнительного файла 1, который должен учитывать оба предложения, а также предоставлять информацию о необработанных данных.

    — Данные будут дополнительно уточнены путем добавления линий клеток, используемых в легендах рисунков.

    Готово (см. измененные подписи к рисункам 1, 4, 5 и 8).

    — На рисунке 7 разметка номера строки внизу или вверху может помочь неспециалистам в интерпретации данных.

    Готово (см. пересмотренный рисунок 7B, где мы пометили ряды зубцов в кутикуле дикого типа).

    https://doi.org/10.7554/eLife.59879.са2

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

    CREB-зависимая передача сигналов, индуцированная LPA, инициирует профиброзную петлю обратной связи между базальными клетками малых дыхательных путей и фибробластами | Respiratory Research

    Сбор образцов эпителия мелких дыхательных путей и выделение базальных клеток

    Эпителиальные клетки мелких дыхательных путей собирали с помощью фиброоптической бронхоскопии с чисткой щеткой, как описано ранее [32]. Все доноры были здоровыми некурящими (см. Дополнительный файл 1: Таблица SI). Клетки удаляли с кисточек, постукивая кончиком кисточки по 5 мл охлажденной льдом полной среды PneumaCult ExPlus (StemCell Technologies, Кембридж, Массачусетс).Собранные эпителиальные клетки дыхательных путей осаждали центрифугированием (250 × g, 5 мин) и дезагрегировали путем ресуспендирования в 0,05% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА; Invitrogen, Карловы Вары, Калифорния) в течение 5 мин при 37 °C. Трипсинизацию останавливали добавлением забуференного HEPES солевого раствора (Lonza, Базель, Швейцария) с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки (FBS; Invitrogen), и клетки однократно промывали 5 мл забуференного фосфатом солевого раствора, pH 7,4 (PBS). при 23 °C и ресуспендировали в 5 мл полной среды PneumaCult ExPlus.

    Для выделения РМЖ эпителиальные клетки (2,5 × 10 5) помещали в колбы T25 в 5 мл полной среды ExPlus и выдерживали во влажной атмосфере с 5% CO 2 при 37 °C. На следующий день неприкрепленные клетки удаляли, а среду меняли каждые 2 дня. Для пассирования клеток первичные BC обрабатывали трипсином и высевали при 3000 клеток/см 2 в полной среде PneumaCult ExPlus. На следующий день среду заменили свежей полной средой ExPlus и меняли каждые 2 дня.Замороженные клетки РМЖ сохраняли в запасе из пассажей 1–3. Перед посевом клеток РМЖ 2 мМ раствора коллагена IV (Sigma, Сент-Луис, Миссури) в воде молекулярной чистоты (Hyclone, Logan, Юта) стерильно фильтровали с использованием фильтра Millipore 0,2 мкм (Sigma), а затем добавляли к культуре клеток. колбу и инкубировали при 37 °C в течение 1 часа. Раствор коллагена IV отсасывали, колбу трижды промывали в PBS и стерилизовали УФ-светом. После оттаивания BC центрифугировали в течение 5 мин до осаждения. Клетки ресуспендировали в полной среде PneumaCult ExPlus, высевали на покрытые коллагеном флаконы для клеточных культур и выращивали до 70–80% слияния для использования в эксперименте.

    Стимуляция LPA базальных клеток малых дыхательных путей

    Для изучения влияния LPA на BC, BC помещали в полную среду PneumaCult ExPlus. Через 24 часа BC дважды промывали PBS, один раз средой ExPlus без добавок и инкубировали со средой ExPlus без добавок в отсутствие (контроль) или в присутствии 1,0 мкг/мл LPA (Echelon Bioscience, Солт-Лейк-Сити, Юта) в течение 3 ч. После 3 часовой инкубации BC собирали с тризолом (Invitrogen) для выделения РНК.

    Экспрессия генов базальных клеток фиброза

    Для количественной оценки экспрессии генов CTGF, EDN1, TGFB1 и PDGFB общую РНК в водной фазе после экстракции тризолом очищали с использованием набора для очистки РНК RNAEasy MinElute (Qiagen, Germantown MD).Концентрацию РНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-100 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). кДНК первой цепи синтезировали из 0,5 мкг тотальной РНК с использованием реагентов обратной транскрипции TaqMan со случайным гексамерным праймированием (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния). Все образцы анализировали в трехкратной повторности при разведении кДНК 1:10. Все реакции проводили на Sequence Detection System 7500 (Applied Biosystems) и относительные уровни экспрессии определяли с использованием метода ΔCt с 18S рибосомной РНК в качестве эндогенного контроля [33].Праймеры включали CTGF (Hs00170014_m1), EDN1 (Hs00174961_m1), TGFB1 (Hs00998133_m1), PDGFB (Hs00966522_m1) и 18 s РНК (Hs99999901_s1) (Applied Biosystems).

    Супернатанты клеточных культур/кондиционированные среды, собранные из BC, анализировали на уровни белков CTGF, ET-1, TGFB1 и PDGFB. Уровни секретируемого CTGF, ET-1, TGFB1 и PDGFB оценивали в среде, кондиционированной BC, с использованием набора ELISA для CTGF ABTS человека (Peprotech, Rocky Hill, NJ), набора ELISA для эндотелина-1 человека (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), человеческого Набор TGF beta 1 ELISA (Abcam, Кембридж, Массачусетс) и набор PDGF-BB Quantikine ELISA (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота) в соответствии с инструкциями производителя.

    Влияние LPA на внутриклеточную сигнализацию базальных клеток

    Для изучения влияния BC, стимулированного LPA, на фосфорилирование киназ и их субстратов, базальные клетки пассажа 3 сначала высевали в полную среду PneumaCult ExPlus в 6-луночные планшеты при 2,5 × 10 5 клеток на лунку. Через 24 часа базальные клетки дважды промывали PBS, один раз средой ExPlus без добавок и инкубировали со средой ExPlus без добавок в отсутствие (контроль) или в присутствии LPA (1,0 г\(мкм\)/мл).После 2,5-минутной инкубации BC собирали с использованием буфера RIPA (ThermoFisher) с ингибиторами протеазы (ThermoFisher) и анализировали на концентрацию общего белка с помощью анализа белка BCA (ThermoFisher). Общий белок (200 мкг) для каждого некурящего BC использовали для анализа экспрессии белка различных фосфорилированных киназ и его субстратов с использованием профилировщика протеома массива фосфокиназ человека (R&D Systems) в соответствии с инструкциями производителя. Результаты были получены путем обнаружения хемилюминесценции и экспонирования фотопленки (Denville Scientific, Metuchen, NJ).Количественную оценку массива фосфокиназы проводили с использованием ImageJ (NIH; [https://imagej.nih.gov/ij/]), примененного к серии экспозиций разного времени, чтобы гарантировать, что экспозиция пленки находилась в линейном диапазоне обнаружения.

    Вестерн-анализ

    LPA-индуцированную передачу сигналов дополнительно исследовали путем определения отношения фосфорилированной формы каждого белка к общему количеству белка с использованием Вестерн-анализа. Лизаты цельных клеток разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с 4–12% додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и переносили на мембрану PVDF с использованием устройства для переноса в соответствии с протоколом производителя (Bio-Rad, Hercules CA).После инкубации с 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА, фракция V; Sigma) в PBST (10 мМ фосфата натрия, pH 8, 150 мМ NaCl, 0,5% Tween 20) в течение 60 мин мембрану однократно промывали PBST и инкубировали с антитела против фосфорилированного CREB (S133) (1:1000, #9191), фосфо-Erk1/2 (Erk1/2; Thr202/Tyr204; 1:1000, #9101) и Erk1/2 (1:1000, #9102), фосфо-p70S6киназа (T389) (1:1000, #9205 и #9234), киназа p70 S6 (T389) (1:1000, #9205 и #9234) (все от Cell Signaling Technology, Danvers MA), фосфо-p70 S6 киназа (1:1000, MAB8963, R&D Systems), GAPDH (1:20000, sc47724, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) при 4°C в течение ночи.Мембраны промывали три раза по 10 мин и инкубировали с вторичными антикроличьими или антимышиными антителами в разведении 1:5000 в течение 1 ч. Мембрану промывали три раза в течение 15 минут PBS и определяли с помощью хемилюминесцентной системы обнаружения (ECL; Thermo Fisher) в соответствии с протоколом производителя.

    Влияние ингибиторов сигнального пути

    Для изучения влияния ингибиторов сигнального пути на экспрессию профибротических факторов роста РМЖ, стимулируемую LPA, РМЖ сначала высевали в полную среду PneumaCult ExPlus.Через 24 ч BC дважды промывали PBS, один раз — средой ExPlus без добавок и инкубировали в течение 3 ч со средой ExPlus без добавок в отсутствие (контроль) или в присутствии LPA (1,0 г\(\mu\)/мл)\( \pm\) сигнальные ингибиторы: ингибитор CREB 666-15 (200 нМ; Echelon Biosciences, Солт-Лейк-Сити, Юта), ингибитор ERK1/2 LY3214996 (5,0 M\(мкм\); Med Chem Express, Monmouth Junction, NJ) , ингибитор EGFR AG1478 (10,0 М\(мк\); CalBiochem, Сан-Диего, Калифорния). Для CREB и ингибитора EGFR добавляли 0,005% или 0,01% ДМСО соответственно в качестве контроля носителя.После инкубации культуры РМЖ собирали с тризолом для выделения РНК. Количественную ПЦР использовали для оценки экспрессии фактора роста, как описано выше.

    Для оценки влияния сигнальных ингибиторов на LPA-стимулированную секрецию профибротических белков из BC клетки сначала высевали в полную среду PneumaCult ExPlus в 6-луночные планшеты, как описано выше. Через 24 часа BC инкубировали с полной средой PneumaCult ExPlus в отсутствие (контроль) или в присутствии ингибиторов передачи LPA (1 г\(\мк\)/мл) \(\pm\), как описано выше.После 3-часовой инкубации BC дважды промывали PBS, один раз — средой ExPlus без добавок и инкубировали со средой ExPlus без добавок. BC либо сразу собирали с тризолом для анализа мРНК, как описано выше, либо после 24-часовой инкубации супернатанты среды/культуры, кондиционированной BC, собирали и оценивали на наличие фиброзных факторов с помощью анализа ELISA, как описано выше.

    Влияние LPA-стимулированных сред, кондиционированных BC, на фибробласты

    Для изучения влияния LPA-стимулированных сред, кондиционированных BC, на пролиферацию нормальных фибробластов легких человека (NHLF) в отсутствие (контроль) или в присутствии ингибиторов передачи сигналов для CREB, Erk1 /2 или EGFR, NHLF высевали в среду для роста фибробластов (FGM-2 с добавлением 2% FBS, 0.1% bFGF, 0,1% инсулин, 0,1% GA-1000; Лонца). Через 24 часа NHLF дважды промывали PBS, один раз средой ExPlus без добавок и инкубировали со средой PneumaCult ExPlus без добавок. Еще через 24 часа NHLF инкубировали с 500 мкл среды PneumaCult ExPlus без добавок (контроль) или 500 мкл неразбавленной среды, стимулированной LPA и кондиционированной BC. После 48 часов инкубации в кондиционированной среде NHLF обрабатывали трипсином и подсчитывали с использованием исключения трипанового синего.

    Для изучения влияния LPA-стимулированных сред, кондиционированных BC, на нормальную экспрессию генов фибробластов легких человека (NHLF), миофибробластов (ACTA2), коллагена I (COL1A1) или аутотаксина (ENPP2) в отсутствие (контроль) или в присутствии ингибиторов передачи сигналов для CREB, Erk1/2 или EGFR сначала высевали NHLF и обрабатывали, как описано выше.После 24-часовой инкубации в кондиционированной среде NHLF собирали с тризолом для выделения РНК, как описано выше.

    Для оценки влияния LPA-стимулированных сред, кондиционированных BC, на экспрессию и секрецию белков в NHLF в отсутствие (контроль) или в присутствии ингибиторов передачи сигналов (описано выше), NHLF высевали и обрабатывали средой, как описано в предыдущий абзац. После 24-часовой инкубации в кондиционированных средах супернатанты культуры NHLF собирали и оценивали на содержание коллагена I или аутотаксин.Чтобы дополнительно охарактеризовать секрецию аутотаксина, измеряли уровни LPA, ферментативного продукта аутотаксина, в среде для культивирования клеток. Уровни коллагена I, аутотаксина и LPA определяли в среде, кондиционированной NHLF, с использованием анализов ELISA. Набор ELISA для человека COL1A1 (MyBioSource, La Jolla, CA), набор ELISA для человека ENPP2 (R&D Systems), набор ELISA для человека LPA (Echelon Biosciences) выполняли в соответствии с инструкциями производителя.

    Для изучения влияния LPA-стимулированных сред, кондиционированных BC, на экспрессию NHLF гладкомышечного актина (ACTA2), после посева и обработки NHLF средой, стимулированной LPA, BC-кондиционированными в течение 24 ч, как описано выше, NHLF собирали с помощью лизис, как описано выше.Уровни белка ACTA2 определяли с помощью анализа ELISA для человеческого ACTA2 (Abcam) в соответствии с инструкциями производителя.

    Статистический анализ

    Статистические сравнения были рассчитаны с использованием непарного двустороннего критерия Стьюдента с равной дисперсией и вложенного дисперсионного анализа с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния), где p < 0,05 считалось значимым.

    Разрешение на исследование

    Образцы эпителиальных клеток дыхательных путей были взяты у нормальных, здоровых некурящих добровольцев после получения письменного информированного согласия с одобрением Институционального контрольного совета Медицинского колледжа Вейла Корнелла (IRB) в соответствии с Протоколом № 0

    0391, озаглавленным «Естественная история Экспрессия генов в клетках легких некурящих, курильщиков и бывших курильщиков в норме и при заболеваниях.

    Автор: alexxlab

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.