служат нескольким целям. Они помогают «обеспечить функциональную совместимость, безопасность, надежность и качество, создавая структуру общепринятых передовых методов, и служат фундаментальными строительными блоками для исследований, разработки продуктов и инноваций.(Стандарты и сертификация ASME).

предоставляют информацию и рекомендации для людей, занимающихся проектированием, производством, установкой, проверкой, обслуживанием и/или эксплуатацией оборудования. Они дают производителям и поставщикам услуг утвержденный в отрасли эталон для разработки и предложения своего продукта.

Американский институт нефти (API) — крупнейшая в США торговая ассоциация нефтегазовой промышленности. API занимается разработкой нефтяного и нефтехимического оборудования и стандартов эксплуатации.API поддерживает более 500 стандартов и рекомендуемых практик, касающихся всего, от буровых долот до защиты окружающей среды в этой отрасли.

Особое внимание следует уделить выбору оборудования для нефтяной и газовой промышленности из-за характера продукта. Например, насосы, сертифицированные API, соответствуют требованиям стандарта Американского института нефти для общего обслуживания нефтеперерабатывающих заводов, что означает, что этот насос идеально подходит для применения в нефтеперерабатывающей промышленности, где он может работать при более высоких температурах и давлении по сравнению с другими отраслями с менее агрессивными средами. Приложения.

Американский национальный институт стандартов (ANSI) — это частная некоммерческая организация, которая наблюдает за разработкой добровольных согласованных стандартов или стандартов, с которыми все согласны. Эти стандарты разработаны для систем, продуктов, услуг, процессов и персонала. ANSI работает со многими национальными и международными организациями по стандартизации, чтобы гарантировать соответствие характеристик и характеристик продукции.

Например, насос, сертифицированный ANSI, спроектирован и изготовлен в соответствии со стандартами размеров Американского национального института стандартов.Настоящий Стандарт предусматривает взаимозаменяемость размеров насосов от одного производителя к другому.

Международная организация по стандартизации (ISO) является независимой неправительственной организацией, специализирующейся на разработке добровольных международных стандартов. ISO насчитывает более 19 500 международных стандартов, охватывающих практически все аспекты технологий и бизнеса.

помогают предприятиям сократить расходы за счет оптимизации операций, сведения к минимуму потерь и ошибок и повышения производительности.Они повышают удовлетворенность клиентов за счет повышения качества и предоставляют предприятиям доступ к новым рынкам.

Для нас международные стандарты ISO затрагивают нашу жизнь почти во всех отношениях. Когда продукты и услуги соответствуют этим Стандартам, мы можем быть уверены, что получаем безопасный и надежный продукт или услугу.

Американское общество инженеров-механиков (ASME) — некоммерческая членская организация, разрабатывающая согласованные стандарты в области машиностроения.ASME отвечает за более чем 500 стандартов, охватывающих все, от простого оборудования, такого как ручные инструменты, до проектирования и эксплуатации электростанций. В ASME есть несколько подгрупп, которые разрабатывают стандарты для технических отраслей по всем направлениям.

Программа сертификации биотехнологического оборудования (BPE) — это стандарт Американского общества инженеров-механиков для оборудования, используемого в биотехнологической, фармацевтической промышленности и производстве средств личной гигиены, где гигиенические стандарты относительно высоки.Программа сертификации BPE устанавливает стандарты проектирования и производства оборудования и систем, используемых в биофармацевтическом производстве. Компании, применяющие Программу сертификации BPE, могут повысить эффективность производства, снизить затраты на разработку и производство, а также повысить качество и безопасность продукции, соблюдая при этом нормативные требования.

European Hygienic Engineering Design Group (EHEDG) — это стандарт производства продуктов питания для европейского рынка, который начинает проникать в Соединенные Штаты.EHEDG НЕ является государственной организацией, а представляет собой группу производителей оборудования и продуктов питания, научно-исследовательских институтов и органов здравоохранения. Их цель — способствовать гигиене при обработке и упаковке пищевых продуктов. Сертификация EHEDG достигается путем проверки и тестирования оборудования и все чаще встречается в Соединенных Штатах. Он похож на 3A, но является фактически проверенной сертификацией, где 3A является только стандартом проектирования.

3A — некоммерческая организация, занимающаяся продвижением гигиенического дизайна оборудования для пищевой промышленности и производства напитков, где требуются строгие гигиенические стандарты.3A представляет интересы трех групп — переработчиков, регулирующих санитарных органов и производителей оборудования. 3A является организацией по разработке стандартов, аккредитованной ANSI, которая работает над продвижением и просвещением общественности в отношении надлежащих санитарно-гигиенических стандартов. В сотрудничестве с производителями оборудования и предприятиями пищевой промышленности организация 3A также разрабатывает санитарные стандарты для проектирования, изготовления, установки и эксплуатации оборудования и машин.

В гигиенической отрасли технологического оборудования растет обеспокоенность по поводу ненадлежащего использования символа 3A, поэтому убедитесь, что ваше оборудование действительно сертифицировано по стандарту 3A.Вы можете узнать больше об этом в нашем блоге: Ложная реклама и 3A: как узнать, действительно ли это сертифицировано 3A.

Приведенные выше определения стандартов касаются только поверхности того, что доступно, поскольку они относятся к производственной и технической промышленности, поэтому при выборе оборудования обязательно работайте с квалифицированным инженером и проводите исследования!

Свяжитесь с нами сегодня, чтобы получить помощь в выборе подходящего оборудования для вашей отрасли на основе изложенных выше стандартов. Мы с удовольствием предоставляем техническую помощь предприятиям в Висконсине и Верхнем Мичигане.

Разноцветный язык: расшифровка служебной маркировки, нанесенной аэрозольной краской на городских улицах

В 1976 году строители случайно врезались в нефтепровод, проходящий под улицами Калвер-Сити, штат Калифорния, что привело к смертельному взрыву, практически сравнявшему с землей половину городского квартала. Это была не первая и не последняя авария такого рода, но она помогла ускорить систематизацию важных цветных служебных обозначений — загадочно выглядящих меток, которые выглядят бессмыслицей или секретным кодом, пока вы не начнете их расшифровывать.

В тот роковой день 15 июня рабочие раскапывали бульвар Венис, чтобы расширить дорогу, когда случилась катастрофа. Газ под давлением из разорванной линии воспламенился, превратившись в огненный шар, и дым поднялся на сотни футов в воздух. Пламя охватило предприятия и многоквартирные дома вдоль квартала, в результате чего десятки человек погибли и получили ранения. Три месяца спустя штат создал систему DigAlert, с которой подрядчики и граждане могут связываться при планировании подземных раскопок, чтобы избежать будущих бедствий.

Отслеживание рабочих зон и того, что находится под землей, может быть сложной задачей, поэтому такие организации, как DigAlert, требуют использования белого цвета (краски, мела, муки или флажков) для обозначения строительных зон, а также единых цветовых кодов, разработанных Американской ассоциацией общественных работ (APWA). ) для временной разметки подземных коммуникаций. Эти «безопасные цвета» были оформлены Американским институтом стандартов (ANSI) как код безопасного цвета Z535.

• Красный: линии электропередач, кабели, кабелепроводы и кабели освещения
• Оранжевый: телекоммуникационные, сигнальные или сигнальные линии, кабели или трубопроводы
• Желтый: природный газ, нефть, пар, нефть или другие легковоспламеняющиеся вещества
• Зеленый: канализация и дренажные линии
• Синий: питьевая вода
• Фиолетовый: линии регенерированной воды, орошения и навозной жижи
• Розовый: временная геодезическая маркировка, неизвестные/неопознанные объекты
• Белый: предлагаемые границы или маршруты раскопок

Эти цвета охватывают основные категории невидимых опасностей, которые рабочие должны учитывать, но они являются лишь частью уравнения.Обозначения также необходимы для отслеживания местоположения, ширины и глубины кабелепроводов, кабелей и труб и идентификации соответствующей коммунальной компании. Соответственно, Common Ground Alliance поддерживает ряд руководств по разграничению полей объектов оператора, чтобы указать, где и как отмечать элементы стрелками, цифрами и символами.

Ставки высоки для подземных раскопок и строительных проектов. Небрежное копание может привести к чему угодно: от серьезного отключения коммунальных услуг до эвакуации из-за утечки газа (или похуже).Попадание в водопроводную магистраль также может вызвать локальное наводнение или потребовать предупреждения о кипячении воды. В США, благодаря Закону о повышении безопасности трубопроводов 2002 года, большинство муниципалитетов требуют, чтобы люди звонили, прежде чем копать. Затем коммунальные службы отправят людей, чтобы отметить подземные опасности. Другие страны также разработали различные аналогичные системы, чтобы избежать несчастных случаев.

Расшифровка кодов коммунальных услуг по всему миру

В некоторых местах, например в Шотландии, экскаваторам предлагают подробные карты инженерных сетей, но, например, в остальной части Великобритании люди самостоятельно находят препятствия и избегают их.Таким образом, многие полагаются на CAT (инструменты обхода кабелей) для выявления опасностей. При работе с металлическими трубами и кабелями электромагнитное оборудование может помочь рабочим «видеть» под поверхностью. Для пластиковых или бетонных труб используется георадар.

В разных странах также используются разные цветовые схемы и маркировка, часто с некоторым перекрытием (например, синий для воды). На британских дорогах многие цвета одинаковы. как в США, но некоторые отличаются (например,г. зеленый используется для телекоммуникаций, а не для канализации и дренажных линий). Что касается маркировки, число рядом с буквой «D» указывает глубину, а зацикленный символ бесконечности отмечает начало или конец области проекта. Для электрических линий «H/V» означает высокое напряжение, а «L/V» — низкое напряжение, а «S/L» — для уличных фонарей. Для газовых линий «HP» означает высокое давление, «MP» — среднее давление, а «LP» — низкое давление. Имея в руках руководства по стандартам, эти странные иероглифы начинают становиться разборчивыми.

Австралия также имеет свою собственную систему, использующую оранжевый для электричества, желтый для газа, синий для воды, голубой для воздуха, белый для связи, красный для пожарных служб, кремовый для сточных вод, фиолетовый для регенерированной воды, серебристый или серый для пара, розовый для «неизвестно», коричневый для масел и черный для других жидкостей.Большая часть Канады использует ту же систему, что и Соединенные Штаты.

Подземные участки большинства городов изобилуют инженерными сетями, не говоря уже о общественном транспорте и автомобильных туннелях. Отображение и маркировка всего этого — сложная задача, которую часто выполняют сторонние подрядчики, чья единственная задача — найти и пометить потенциальные опасности ниже. Биоразлагаемые краски, которые они используют, обычно предназначены для того, чтобы со временем исчезать, но для тех, кто в курсе, эти странные каракули предоставляют уникальные временные окна в сложные системы, работающие под нашими искусственными средами.И для жителей, а также для работников опасной отрасли эти кодексы необходимы для общественной безопасности и безопасности на рабочем месте.

Обновление : эта история была дополнена дальнейшими исследованиями и включена в книгу The 99% Invisible City Романа Марса и Курта Кольстедта :

Можем ли мы расшифровать информацию, содержащуюся в сигналах циклических нуклеотидов?

Известно, что вторичные мессенджеры, такие как Ca ²⁺ , цГМФ и цАМФ, регулируют различные клеточные функции, включая возбудимость, сокращение, движение, пролиферацию и экспрессию генов.Наше понимание того, как сигналы Ca ²⁺ организуют такие разнообразные клеточные функции, резко возросло за последние сорок лет, в значительной степени благодаря развитию одноклеточных методов измерения внутриклеточного Ca ²⁺ (Tsien, 1992). Наше понимание субклеточной локализации, кинетики и частоты сигналов циклических нуклеотидов сильно отстало. Таким образом, мы только начинаем понимать, как информация кодируется сигналами циклических нуклеотидов.

До недавнего времени исследователи были ограничены отсутствием одноклеточных сенсоров для определения цАМФ и цГМФ в режиме реального времени. Однако в последнее десятилетие несколько групп разработали различные датчики цАМФ и цГМФ на основе связывающих доменов PKA, PKG, CNG-каналов, фосфодиэстераз (PDE) и обменных факторов, активируемых цАМФ (Epacs). Каждый из этих датчиков имеет свои преимущества и недостатки. В этой перспективе мы сначала обрисовываем сильные стороны и ограничения нескольких одноклеточных циклических нуклеотидных сенсоров.Затем мы рассмотрим, как информация может быть закодирована в сигналах циклических нуклеотидов и как современные датчики циклических нуклеотидов могут быть использованы для расшифровки механизмов, лежащих в основе специфичности передачи сигналов. Мы считаем, что лучшее понимание сильных сторон и ограничений этих биосенсоров будет способствовать количественному пониманию передачи сигналов циклических нуклеотидов и поможет направить дизайн зондов следующего поколения.

Одноклеточные сенсоры для цАМФ и цГМФ

Сенсоры на основе PKA.

Более двадцати лет назад Циен и его коллеги опубликовали первый отчет, описывающий новый подход к измерению сигналов цАМФ, основанный на резонансной передаче энергии Фёрстера (FRET) (Adams et al., 1991). Они пометили каталитическую и регуляторную субъединицы PKA типа I флуоресцентным донором (флуоресцеином) и акцептором (родамином). Когда концентрации цАМФ были низкими, субъединицы находились в холоферментном комплексе, и между флуоресцеином и родамином возникала FRET. Однако, когда уровни цАМФ были высокими, цАМФ связывался с регуляторными субъединицами, каталитические субъединицы диссоциировали, и FRET уменьшался.Этот оригинальный метод был описан как датчик цАМФ в реальном времени (Adams et al., 1991; Goaillard et al., 2001; Gorbunova and Spitzer, 2002). Однако существуют ограничения на его использование:

(1) Реассоциация субъединиц PKA может быть медленной (Rich and Karpen, 2002, и ссылки в ней).

(2) PKA регулируется (высокими) физиологическими концентрациями цГМФ (Francis and Corbin, 1999).

(3) Флуоресцентно меченный PKA каталитически активен (Adams et al., 1991; Goaillard et al., 2001).

(4) Высокие концентрации меченой PKA необходимы для подавления эндогенной PKA (в противном случае связывание флуоресцентно меченных субъединиц с эндогенными субъединицами будет искажать сигналы FRET). PKA имеет высокое сродство к цАМФ. Высокие концентрации высокоаффинных буферов сильно притупляют сигналы цАМФ (Rich and Karpen, 2002).

Эти ограничения препятствуют использованию помеченного ПКА в качестве сенсора цАМФ. Однако эта работа побудила исследователей из нескольких групп разработать новые зонды цАМФ и цГМФ, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.

Датчики циклических нуклеотидов на основе каналов CNG.

Две группы разработали генетически модифицированные каналы CNG, которые напрямую открываются при связывании циклических нуклеотидов, в качестве сенсоров циклических нуклеотидов (Trivedi and Kramer, 1998; Rich et al., 2000, 2001b). В отличие от многих других ионных каналов, CNG-каналы не теряют чувствительности в ответ на длительное воздействие циклических нуклеотидов (Dhallan et al., 1990; Rich et al., 2000, 2001a), что делает их пригодными для мониторинга уровней циклических нуклеотидов. Открытые каналы позволяют катионам (Na ⁺ , K ⁺ , Ca ²⁺ ) проходить через поверхностную мембрану; таким образом, активация каналов CNG легко обнаруживается с помощью электрофизиологических методов или методов визуализации Ca ²⁺ .CNG-каналы имеют несколько других характеристик, которые подходят для конкретных экспериментальных планов и исключают их из других:

(1) CNG-каналы имеют быструю кинетику (время нарастания 90% за <0,2 с), что позволяет измерять быстрые изменения уровней циклических нуклеотидов. вблизи плазматической мембраны (Rich et al., 2000).

(2) Каналы CNG нацелены на плазматическую мембрану, что позволяет проводить измерения локализованного в мембране цАМФ. Однако они не могут быть легко использованы в других областях клетки.

(3) Активность канала CNG легко обнаруживается при низких уровнях экспрессии. Таким образом, буферизация циклических нуклеотидов низка и в большинстве случаев не будет существенно изменять уровни циклических нуклеотидов (Rich and Karpen, 2002).

(4) CNG-каналы регулируются другими внутриклеточными сигналами, включая PIP3 и Ca ²⁺ (Brady et al., 2006). Таким образом, требуется тщательный контроль, чтобы гарантировать, что измеренные ответы действительно вызваны изменениями уровней циклических нуклеотидов.

(5) Измерения с высоким кинетическим разрешением требуют электрофизиологии; электрофизиологические эксперименты считаются технически более сложными, чем эксперименты с визуализацией.Проницаемость Ca ²⁺ каналов CNG использовалась для обнаружения изменений в цАМФ путем мониторинга внутриклеточных уровней Ca ²⁺ (Rich et al., 2001b).

(6) Каналы CNG проводят Ca ²⁺ . Таким образом, эксперименты необходимо проводить в отсутствие внеклеточного Ca ²⁺ , чтобы избежать CNG-канал-опосредованной регуляции Ca ²⁺ синтеза и деградации циклических нуклеотидов.

Эта комбинация достоинств и ограничений делает каналы CNG хорошо подходящими для измерения кинетики околомембранных сигналов (Rich and Karpen, 2002).Однако каналы CNG плохо подходят для изучения обратных взаимодействий между Ca ²⁺ , фосфоинозитидом и сигнальными путями циклических нуклеотидов.

Датчики циклических нуклеотидов на основе Epac.

Несколько групп разработали датчики цАМФ на основе FRET с использованием цАМФ-связывающего белка Epac для измерения сигналов цАМФ в различных клеточных доменах (Николаев и др., 2004; Ponsioen et al., 2004). Эти сенсоры состоят из каталитически неактивного Epac, расположенного между флуоресцентным донором (CFP) и флуоресцентным акцептором (YFP; Ponsioen et al., 2004). В базовом состоянии (низкий уровень цАМФ) эффективный FRET происходит между CFP и YFP. Когда цАМФ связывается с Epac, происходит конформационное изменение, снижающее эффективность FRET. Доступно несколько версий зонда Epac (van der Krogt et al., 2008; Klarenbeek et al., 2011), а также зонды на основе FRET для измерения цГМФ (Николаев и др., 2006). Эти датчики на основе FRET имеют схожие преимущества и недостатки.

(1) Зонды могут быть легко нацелены на различные внутриклеточные местоположения (Terrin et al., 2006).

(2) Хотя кинетика активации Epac не была тщательно измерена, экспериментальные измерения показывают, что датчики на основе Epac достаточно быстры, чтобы достоверно воспроизводить большинство сигналов цАМФ.

(3) В целом измерения флуоресценции и FRET технически просты в выполнении (Börner et al., 2011). Однако калибровка этих сенсоров в интактных клетках затруднена, потому что редко можно продемонстрировать, что были достигнуты как минимальный, так и максимальный уровни флуоресценции или FRET.

(4) Датчики FRET на основе Epac имеют ограниченный диапазон и высокий уровень фона (), что приводит к низкому отношению сигнал/шум. Это еще более осложняется отсутствием надлежащего сравнения обычно используемых подходов к визуализации и анализу FRET. Лишь недавно исследователи количественно оценили отношение сигнал/шум при различных подходах к анализу (Leavesley et al., 2013). И хотя был достигнут значительный прогресс в разработке датчиков FRET с увеличенным радиусом действия (Klarenbeek et al., 2011), фактический динамический диапазон датчиков FRET не был адекватно оценен. Таким образом, неясно, какие приращения цАМФ или цГМФ можно различить на самом деле.

Измерения кажущегося FRET. (A-C) Репрезентативные ответы от клеточных лизатов клеток HEK-293, экспрессирующих зонд FRET на основе Epac (A), CFP (B) или YFP (C). Измерения проводились, как описано ранее (Leavesley et al., 2013; Rich et al., 2013). Вкратце, клеточные лизаты суспендировали в кювете с мешалкой (4×10 ⁶ клеток в 4 мл) и возбуждали при 430 нм, затем измеряли интенсивность эмиссии от 450 до 650 нм с помощью спектрофлуориметра.Данные нормированы на пиковую интенсивность. (A) Изменение видимого ответа FRET, измеренного при 0 и 10 мкМ цАМФ (черные и серые линии соответственно). Обратите внимание на умеренное изменение FRET, связанное с изменением насыщения цАМФ. (B) Изменение pH от 7 (синяя линия) до 6 (черная линия) мало повлияло на измеренную интенсивность флуоресценции CFP. (C) Изменение pH оказало заметное влияние на измеренную интенсивность флуоресценции YFP. (D и E) Моделирование, демонстрирующее влияние изменения pH на кажущиеся измерения FRET и интерпретацию основных сигналов цАМФ.

(5) Уровни (сверх)экспрессии Epac не измерялись; таким образом, эффекты буферизации циклических нуклеотидов не могут быть адекватно оценены (обсуждается позже).

(6) Лишь недавно были реализованы систематические автоматизированные подходы к анализу измерений FRET (Jalink and van Rheenen, 2009; Leavesley et al., 2013). Такие подходы позволяют объективно оценить эффективность FRET для всех клеток в поле зрения, а также установить четкие критерии исключения определенных клеток из анализа.

Артефакты, связанные с зондами на основе флуоресценции и FRET.

Флуоресцентные белки и флуорофоры в целом можно модифицировать с помощью различных биохимических процессов. Некоторые из факторов, которые могут влиять на испускание флуоресценции, рассматриваются ниже.

(1) Гетерологически экспрессируемые белки, особенно направленные конструкции, могут накапливаться в различных субклеточных локализациях. Таким образом, может происходить как межмолекулярный, так и внутримолекулярный FRET.

(2) Обычно используемые флуоресцентные белки по-разному чувствительны к переменным условиям окружающей среды, включая температуру, pH, активные формы кислорода (АФК) и вязкость (Bernas et al., 2005; Ха и Тиннефельд, 2012). Этим артефактам подвержены как спектральные измерения, так и измерения времени жизни (Suhling et al., 2002). Чтобы проиллюстрировать потенциальные проблемы, связанные с изменениями в окружающей среде, мы измерили влияние pH на эмиссию флуоресценции от CFP и YFP. Мы заметили, что изменение pH от 7 до 5 мало влияло на флуоресценцию CFP (), но заметно влияло на флуоресценцию YFP (). Чтобы проиллюстрировать потенциальные проблемы, связанные с опосредованными рН изменениями при очевидных измерениях FRET, мы смоделировали влияние постоянного рН 7.0 или изменение pH с 7 до 6 при кажущейся реакции FRET. В этом сценарии входной сигнал цАМФ повышался от исходного уровня до устойчивого плато примерно за 30 с. Мы предположили, что pKa CFP равнялось 5, а pKa YFP равнялось 7. Изменение pH вызывало общее снижение FRET (4). Если бы эффекты pH не были должным образом учтены, то интерпретируемый сигнал цАМФ был бы временным, а не устойчивым. Хотя это был наихудший сценарий для pH, другие факторы окружающей среды могут по-разному влиять на эмиссию флуоресцентных белков.Это может стать особенно проблематичным в локализованных областях клетки, таких как митохондрии.

Некоторые пары FRET обладают повышенной фотостабильностью и пониженной чувствительностью к pH (van der Krogt et al., 2008), и по возможности следует использовать эти пары FRET. Однако влияние других переменных окружающей среды на эти флуорофоры не оценивалось. Таким образом, необходимо разработать систематические подходы для обнаружения и компенсации изменений окружающей среды во флуоресценции и кажущейся FRET.

Другие одноклеточные датчики циклических нуклеотидов в режиме реального времени.

Зонды на основе FRET для цГМФ также были разработаны. Эти зонды используют сайты связывания cGMP из каналов PKG, PDE2, PDE5 и CNG, расположенных между флуоресцентными донорами и акцепторами (Honda et al., 2005; Nikolaev et al., 2006). Эти зонды имеют те же преимущества и недостатки, что и зонды цАМФ на основе FRET, описанные ранее. Однако зонды цГМФ на основе FRET не получили столь широкого распространения, отчасти потому, что Достманн и его коллеги разработали зонды, в которых сайт связывания цГМФ PKG был слит с усиленным зеленым флуоресцентным белком с круговой пермутацией (Nausch et al., 2008). Хотя эти зонды обладают высокой чувствительностью, большим диапазоном и, вероятно, большим динамическим диапазоном, экспериментальное применение этих зондов не всегда прямолинейно, а эмиссия флуоресценции зависит от изменений окружающей среды, а также изменений в цГМФ.

Несмотря на ограничения общей применимости зондов циклических нуклеотидов на основе FRET, а интерпретация данных не всегда проста, эти зонды FRET являются наиболее широко используемыми датчиками циклических нуклеотидов на сегодняшний день.Относительная простота использования и способность нацеливаться на различные области клетки позволяют зондам на основе FRET легко обнаруживать изменения в локализованных уровнях циклических нуклеотидов.

Далее мы рассмотрим сильные стороны и ограничения различных сенсоров циклических нуклеотидов, уделяя особое внимание сенсорам на основе FRET, при расшифровке информационного содержания сигналов циклических нуклеотидов.

Как информация может быть закодирована в сигналах вторичных мессенджеров?

Сигналы циклических нуклеотидов регулируют десятки клеточных процессов во временных масштабах от секунд до часов (Francis and Corbin, 1999, и ссылки там).Однако остается неясным, как кодируется информация, необходимая для дифференциальной регуляции множества клеточных функций. Было предложено несколько концепций, включая кодирование информации в пространственном распределении сигналов (разделение), в частотном содержании сигналов (частотное кодирование) или в комбинации сигналов, которые включаются или выключаются, выше или ниже порогов, в заданное время (цифровое кодирование; Brooker, 1973; Hanson et al., 1994; Dolmetsch et al., 1998; Rich and Karpen, 2002; Ruf et al., 2006; Файнштейн и др., 2012). Эти механизмы описаны в следующих разделах.

Пространственное кодирование информации в сигналах циклических нуклеотидов.

Пространственное кодирование сигналов циклических нуклеотидов или компартментализация сигналов требует, чтобы уровни цАМФ и цГМФ были достаточно высокими для активации каналов PKA, PKG, Epac или CNG в одной области клетки, но не в других. Доказательства этого феномена очевидны: повышение уровня цАМФ, вызванное различными гормонами, регулирует различные клеточные процессы.Например, в сердечных миоцитах два агента, которые вызывают одинаковое повышение уровня общего клеточного цАМФ, — изопротеренол и простагландин E ₁ (PGE ₁ ) — имеют заметно различающиеся последующие эффекты (см. Saucerman et al. в этом выпуске). Обработка сердечных миоцитов изопротеренолом, агонистом β-адренорецепторов, запускает цАМФ-зависимую активацию PKA и последующее фосфорилирование белков, связанных с сердечной возбудимостью; однако обработка PGE ₁ запускает цАМФ-зависимую активацию PKA, но не фосфорилирование этих белков.Это было частично объяснено наблюдением, что эти агенты активируют разные пулы PKA: твердые и растворимые (Corbin et al., 1977). Идея локализованных пулов активности PKA была дополнительно подтверждена открытием белков, закрепляющих A kinase (AKAPs), каркасов, которые привязывают PKA к клеточным мишеням (см. Kapiloff et al. в этом выпуске). Однако пространственной близости белков, связанных с этим сигнальным путем, например, β ₂ -адренорецепторов, аденилатциклазы (AC), PKA и каналов L-типа Ca ²⁺ , недостаточно для обеспечения локализованных ответов (Feinstein и другие., 2012; Saucerman et al., 2014 и ссылки в нем). Сам сигнал должен быть пространственно ограничен.

Мы и др. использовали компартментальные модели для описания локализации сигналов циклических нуклеотидов (Saucerman et al., 2014 и ссылки в них). Здесь мы представляем обновленную компартментальную модель, основанную на наших недавних оценках околомембранной активности ФДЭ. В этой модели цАМФ продуцируется AC в отсеке 1. Общая активность ФДЭ заметно ниже в отсеке 1, чем в отсеке 2 (уравнения и значения параметров приведены в дополнительном тексте).При ступенчатой ​​активации AC концентрации цАМФ в компартменте 1 достигают плато >3 мкМ в течение 10 мин. Диффузионные ограничения, которые замедляют поток цАМФ между компартментами, и более высокая активность ФДЭ в компартменте 2 притупляют накопление цитозольного цАМФ до <0,5 мкМ.

Схематическая модель разделенных сигналов цАМФ. (A) Модель с двумя отсеками с диффузионными ограничениями между локализованным в мембране микродоменом (отсек 1) и объемным цитозолем (отсек 2).Подробности смотрите в тексте. (B) Циклические сигналы AMP, вызванные активацией переменного тока. Уровни циклического АМФ в отсеке 1 заметно выше, чем в отсеке 2. (C) Общее накопление клеточного цАМФ за тот же период времени.

Механизмы, с помощью которых этот быстро диффундирующий мессенджер локализуется в различных областях клетки, изучены недостаточно. Потенциальные механизмы локализации сигнала подробно обсуждались в других источниках (Feinstein et al., 2012; Conti et al. в этом выпуске; Saucerman et al., 2014). Здесь мы выделяем четыре механизма, которые могут способствовать локализации сигнала и, таким образом, специфичности сигнальных путей цАМФ и цГМФ:

(1) Колокализация сигнальных белков (например, рецепторов, G-белков, AC, PDE, PKA, фосфатаз и нижестоящие мишени) в сигнальные комплексы является важным компонентом обеспечения специфичности передачи сигналов. Однако маловероятно, что локализация сигнальных белков сама по себе объясняет пространственную сегрегацию сигналов цАМФ, поскольку без ограничения пространственного распространения цАМФ и цГМФ быстро диффундируют по клетке (Piggott et al., 2006; Файнштейн и др., 2012; Saucerman et al., 2014 и ссылки в нем). Скорее, эти сборки гарантируют, что сигнальные белки испытывают одни и те же сигналы и что PKA и PKG готовы фосфорилировать специфические нижележащие мишени.

(2) Физические барьеры могут замедлять скорость диффузии цАМФ из одной области клетки в другую. Имеются убедительные доказательства того, что ER или SR плотно прилегают к плазматической мембране и ограничивают пространственное распространение Ca ²⁺ и Na ⁺ в специализированных клетках, таких как волосковые клетки, нейроны и сердечные миоциты.Такие барьеры могут частично ограничивать пространственное распространение циклических нуклеотидов. Кроме того, кортикальный ободок F-актина может замедлять движение цАМФ из-за стерических затруднений и эффектов заряда. Кроме того, F-актиновые сети могут запускать гелеобразование цитозоля, резко снижая локальный эффективный коэффициент диффузии в примембранном пространстве. Для более полного обсуждения см. Feinstein et al. (2012) и Saucerman et al. (2014) и ссылки в нем.

(3) Буферизация может способствовать медленному пространственному распространению сигналов цАМФ и цГМФ.Это может быть особенно важно, когда высокие концентрации PKA локализуются в отдельных областях клетки с помощью AKAP.

(4) Активность ФДЭ ограничивает пространственное распространение сигналов циклических нуклеотидов. Математические модели показывают, что активность ФДЭ особенно эффективна в ограничении пространственного распространения цАМФ и цГМФ, когда сигналы частично разделены диффузионными ограничениями. Роль активности ФДЭ в регуляции кинетики и пространственного распространения сигналов циклических нуклеотидов подробно обсуждалась в других работах (Conti et al., 2014; Сосерман и др., 2014).

Данные, представленные несколькими группами, позволяют предположить, что компартментализация циклических нуклеотидов является критическим компонентом специфичности передачи сигналов, как обсуждалось в Conti et al. (2014), Kapiloff et al. (2014) и Saucerman et al. (2014). Представленная здесь модель иллюстрирует, как диффузионные барьеры и вариабельная активность PDE могут обеспечивать различные сигналы циклических нуклеотидов в разных субклеточных местах. Множественные компартменты, содержащие локализованные в каркасе сигнальные комплексы, вероятно, вносят вклад в специфичность передачи сигналов в нескольких внутриклеточных сигнальных путях.Локализованные сигнальные комплексы могут также контролировать перекрестные помехи между сигнальными путями, способствуя как частотно-зависимым, так и цифровым сигналам.

Для выяснения механизмов, лежащих в основе пространственной сегрегации сигналов циклических нуклеотидов, использовались два основных подхода. Первый подход основан на датчиках, локализованных в дискретной области клетки, таких как канал CNG, локализованный на плазматической мембране, и на изменении местоположения источника циклических нуклеотидов.Например, Пигготт и др. (2006) исследовали способность цГМФ, продуцируемого GC в виде частиц (pGC) и растворимого GC (sGC), активировать каналы CNG как в клетках HEK-293, так и в клетках гладкой мускулатуры сосудов. Они обнаружили, что через 10 минут цГМФ, продуцируемый pGC, легко активировал CNG-каналы, тогда как цГМФ, продуцируемый рГЦ, не активировался даже в присутствии ингибиторов ФДЭ. В концептуально подобных экспериментах исследователи диализовали известные концентрации циклических нуклеотидов в клетках и измеряли активацию CNG-каналов для оценки эффективного коэффициента диффузии (Koutalos et al., 1995; Чен и др., 1999; Рич и др., 2000). Недавно мы использовали аналогичный подход, чтобы предоставить доказательства того, что ФДЭ4 ниже в примембранном компартменте, чем в объемном цитозоле (неопубликованные данные). Хотя эти основные подходы позволяют количественно оценить усредненный эффективный коэффициент диффузии по всей клетке, их нельзя использовать для дальнейшего анализа пространственного распространения сигналов циклических нуклеотидов, поскольку измерения активности CNG-каналов локализованы в плазматической мембране.

Второй подход сравнивает ответы, измеренные в разных субклеточных местах. Различные исследования сравнивали CNG-каналы с изменениями общего уровня клеточных циклических нуклеотидов (Rich et al., 2000, 2001a; Piggott et al., 2006), CNG-каналы и растворимые зонды FRET (Rochais et al., 2006; Willoughby et al. , 2006), зонды FRET, основанные на различных сайтах связывания циклических нуклеотидов (Warrier et al., 2007), и зонды FRET, локализованные в разных субклеточных компартментах (Saucerman et al., 2006; Террин и др., 2006; Блэкман и др., 2011). Как указывалось ранее, способность зондов на основе флуоресценции и FRET нацеливаться на дискретные субклеточные домены делает их хорошо подходящими для таких исследований. Однако интерпретация данных не обязательно проста. Например, изменения вязкости и АФК в примембранном пространстве могут по-разному изменять эмиссию флуоресценции донора и акцептора (например, CFP и YFP). Точно так же динамические изменения АФК и рН в митохондриях могут затруднить интерпретацию измерений FRET.Кроме того, как отмечалось ранее, локализованные зонды FRET могут достигать концентраций, при которых происходит как внутримолекулярный, так и межмолекулярный FRET. Таким образом, необходимо проявлять большую осторожность при сравнении величины или кинетики флуоресценции и измерений FRET из разных субклеточных областей. Мы считаем, что до тех пор, пока не будут разработаны более систематические подходы к мониторингу эффектов изменения клеточной среды, лучшим подходом будет использование нескольких датчиков для одного и того же измерения. Например, Блэкман и др.(2011) использовали таргетные зонды FRET, CNG-каналы, радиоиммуноанализы и измерения нижестоящей эффекторной активности для выяснения специфической роли изоформ PDE4, локализованных в дискретных субклеточных компартментах.

Частотное кодирование информации в сигналах циклических нуклеотидов.

Хотя компартментализация, по-видимому, вносит большой вклад в специфичность передачи сигналов, другие механизмы, такие как частотно-зависимая передача сигналов, вероятно, вносят свой вклад в содержание информации в системах вторичных мессенджеров.Зависимая от частоты передача сигналов подразумевает, что нижестоящие эффекторы реагируют на определенные частоты в сигналах. Другими словами, эффекторы могут по-разному реагировать на быстрые колебания уровней циклических нуклеотидов, чем на медленные колебания. Колебания уровня цАМФ были предложены почти сорок лет назад (Brooker, 1973; Wollenberger et al., 1973). Математическое моделирование показало, что обратные взаимодействия между Ca ²⁺ -ингибируемыми AC и Ca ²⁺ -проницаемыми ионными каналами могут приводить к стабильным колебаниям уровней цАМФ (Cooper et al., 1995). Сходным образом моделирование показало, что опосредованная Ca ²⁺ стимуляция активности PDE может также вызывать стабильные колебания уровней цАМФ (Rich and Karpen, 2002). Экспериментальные доказательства того, что уровни cAMP могут колебаться, были предоставлены Reisert and Matthews (2001), которые наблюдали колебания токов через CNG-каналы обонятельных ресничек в ответ на устойчивые одоранты. Более поздние исследования на β-клетках продемонстрировали колебания цАМФ и важность пульсирующей продукции цАМФ для поддержания этих колебаний (Dyachok et al., 2006; Тиан и др., 2012). Умное использование Ca ²⁺ -стимулируемой системы сверхэкспрессии AC8 прояснило возможность перекрестных помех между путями cAMP и Ca ²⁺ и скоординированных колебаний из-за взаимодействий обратной связи между путями (Willoughby and Cooper, 2006). Zhang и коллеги предоставили убедительные экспериментальные доказательства того, что медленные осцилляции цАМФ запускают осцилляции PKA (Ni et al., 2011). Хотя есть существенные доказательства того, что колебания циклических нуклеотидов имеют место, количество исследований, описывающих эти колебания, невелико, особенно по сравнению с обильным описанием колебаний Ca ²⁺ .Таким образом, у нас остается вопрос: ограничивают ли экспериментальные трудности нашу способность обнаруживать осцилляции циклических нуклеотидов или такие осцилляции являются редким эпифеноменом?

Мы считаем, что экспериментальные ограничения препятствуют нашей способности обнаруживать колебания циклических нуклеотидов. Зонды цАМФ на основе PKA, разработанные более двадцати лет назад, не обладали быстрой кинетикой для обнаружения быстрых изменений уровней цАМФ (Rich and Karpen, 2002). Буферизация сигналов цАМФ также была проблематичной из-за клеточной микроинъекции или сверхэкспрессии высоких концентраций зонда.Это еще более усложнялось тем фактом, что флуоресцентно меченая PKA является активной киназой. Напротив, быстрое время отклика CNG-каналов и низкая буферная емкость позволяют обнаруживать высокочастотные колебания цАМФ (Rich et al., 2000). Однако каналы CNG являются активными белками, которые обеспечивают приток Na ⁺ и Ca ²⁺ . Таким образом, кинетические эксперименты необходимо проводить в буфере, не содержащем Ca ²⁺ , чтобы предотвратить опосредованную CNG каналом Ca ²⁺ регуляцию ферментов в сигнальной системе, предотвращая изучение взаимодействий Ca ²⁺ -цАМФ.Время отклика зондов на основе FRET для цАМФ и цГМФ более чем достаточно для измерения колебаний с периодом (Т) 30 с, и они не являются активными ферментами. Тем не менее, немногие исследователи смогли измерить циклические нуклеотидные колебания с помощью этого зонда. Чтобы лучше понять, почему, мы разработали реалистичное математическое описание сигнального пути цГМФ (уравнения, а также определения и значения параметров приведены в дополнительном тексте).

В этой модели активация pGC увеличивает накопление внутриклеточного цГМФ.Дефосфорилирование pGC вызывает десенсибилизацию рецепторов и снижение скорости синтеза цГМФ. Циклический ГМФ гидролизуется ФДЭ типа 5 (ФДЭ5), который регулируется связыванием цГМФ с некаталитическим участком и фосфорилированием. Входные данные для модели были аналогичны синусоидальным колебаниям предсердного натрийуретического пептида (ПНП) ​​с периодами (Т) 30, 300 и 3000 с. Уровни активности pGC были аналогичны наблюдаемым экспериментально в ответ на 50 нМ ANP. Эти входы запускали синусоидальное внутриклеточное накопление цГМФ с задержкой, которая менялась в зависимости от частоты стимула (12).Амплитуда колебаний цГМФ увеличивалась с увеличением периода синусоидальной стимуляции. Для зонда цГМФ потребуется высокий динамический диапазон (способность воспроизводимо измерять небольшие изменения цГМФ) для обнаружения ответов цГМФ на колебания ВНП с периодами 30 или 300 с (12). Имеющиеся в настоящее время зонды cGMP FRET не имеют динамического диапазона для адекватной выборки любого сигнала. Точно так же зонды цАМФ, которые используют CFP и YFP в качестве флуоресцентного донора и акцептора, не обладают необходимой чувствительностью для измерения аналогичных колебаний цАМФ в интактных клетках.Из-за их ограниченного динамического диапазона эти датчики на основе FRET способны воспроизводимо обнаруживать только большие колебания циклических нуклеотидов, подобные тем, которые моделируются в ответ на медленные колебания ANP. Способность этих зондов обнаруживать небольшие колебания уровней циклических нуклеотидов дополнительно ограничена их буферной способностью. Чтобы проиллюстрировать это, мы повторили моделирование с экзогенными буферными концентрациями 0,05, 0,5 и 5 мкМ (черная, красная и зеленая линии соответственно).Эти модели демонстрируют, что буферизация зондом может изменить измеряемые сигналы циклических нуклеотидов. В настоящее время мы не можем точно оценить абсолютные концентрации флуоресцентных зондов в отдельных клетках; таким образом, эффекты буферной способности циклических нуклеотидов этих сенсоров неизвестны и, вероятно, варьируются от типа клетки к типу клетки (если не от клетки к клетке). Поэтому сенсорам цГМФ и цАМФ первого поколения, использующим CFP и YFP, не хватает динамического диапазона для воспроизводимого распознавания небольших колебаний уровней циклических нуклеотидов.Однако недавно разработанные датчики cGMP W. Dostmann и его коллегами (Nausch et al., 2008) и датчики cAMP, разработанные K. Jalink и коллегами (Klarenbeek et al., 2011), имеют больший отклик и, вероятно, увеличенный динамический диапазон. Таким образом, эти датчики следующего поколения лучше подходят для обнаружения колебаний циклических нуклеотидов, поскольку они, вероятно, способны обнаруживать изменения с меньшим приращением уровней циклических нуклеотидов и могут экспрессироваться с более слабыми промоторами, что обеспечивает более низкие уровни экспрессии и уменьшенную буферную способность.

Моделирование, изображающее внутриклеточное накопление цГМФ в ответ на колебательный стимул. Пунктирные линии представляют входные данные модели: синусоидальные стимулы с периодами (T) 30 с (A), 300 с (B) или 3000 с (C). Сплошные линии представляют моделирование внутриклеточного накопления цГМФ.

Моделирование, изображающее эффекты буферизации циклическими нуклеотидными зондами. Моделирование изображает ответы цГМФ в клетках, экспрессирующих 0,05 (черные линии), 0,5 (красные линии) и 5 ​​мкМ (зеленые линии) зондов FRET (параметр buf = 0.05, 0,5 и 5 мкМ соответственно). K _1/2 зонда для цГМФ был установлен на 1 мкМ. Входные частоты составляли 30, 300 и 3000 с (как в ). Обратите внимание на разные временные рамки для каждой симуляции. Уравнения, а также определения и значения параметров приведены в дополнительном тексте.

В дополнение к трудностям обнаружения колебаний циклических нуклеотидов, присущих характеристикам первого поколения генетически кодируемых сенсоров циклических нуклеотидов, могут возникнуть трудности с обнаружением колебаний циклических нуклеотидов, локализованных в дискретных субклеточных компартментах.Чтобы проиллюстрировать это, мы смоделировали влияние компартментализации на колебательные сигналы цГМФ. Активность pGC была ограничена околомембранным компартментом (C1), который составлял 10% объема клетки (изображен на рис.). Так, в ферментах С1 концентрации были в 10 раз выше, чем указано в Таблице S2. Затем мы добавили как активность PDE5 (максимальная активность PDE5 2 мкМ/мин), так и базальную активность рГЦ (0,026 мкМ/мин) в цитозольном компартменте (C2). Стимуляция рГЦ не рассматривалась. Мы смоделировали синусоидальный стимул для запуска колебательных колебаний цГМФ.Осцилляторные ответы цГМФ возникали в С1 в ответ на все стимулы (Т = 30, 300 и 3000 с, черные линии). Амплитуда колебаний цГМФ в C1 была больше при более высоких входных частотах по сравнению с моделью с одним отсеком (сравните и). Только небольшие ответы цГМФ наблюдались в С2 (красные линии). Если предположить, что растворимые FRET-зонды будут равномерно распределены по всей клетке (это может быть не так, см. Raymond et al., 2007), то 90% сигнала будет исходить от C2, где уровни цГМФ низкие.Кроме того, использование локализованных в мембране зондов цГМФ увеличило бы концентрацию зонда в С1 и, в свою очередь, увеличило бы буферную способность цГМФ зонда в С1. Ситуация становится более сложной, если флуктуации циклических нуклеотидов происходят вблизи сильно локализованных рецепторных комплексов, а не в значительном субклеточном компартменте, используемом в этом моделировании. Таким образом, выбор зонда и экспериментальных условий, необходимых для запуска и обнаружения колебаний циклических нуклеотидов, может основываться на пробах, ошибках, настойчивости и доле удачи.Частотное содержание больших флуктуаций может быть точно измерено, но амплитуду флуктуаций и эффекты буферизации циклических нуклеотидов зондами оценить трудно.

Моделирование, изображающее внутриклеточное накопление цГМФ в двухкамерной модели в ответ на колебательный стимул. В этой модели цГМФ продуцируется pGC в примембранном отсеке (C1). Уровни цГМФ быстро уравновешиваются в С1, но поток цГМФ в более крупный цитозольный компартмент (С2) идет медленно.Активность ФДЭ5 присутствует как в С1, так и в С2. Базальная активность рГЦ поддерживает низкий исходный уровень цГМФ в С2. Черные линии представляют концентрацию цГМФ в C1 в ответ на синусоидальные колебания стимулов с периодами (T) 30 с (A), 300 с (B) или 3000 с (C). Красные линии представляют накопление цГМФ в С2. Моделирование предполагало отсутствие сенсоров цГМФ, поэтому параметр buf был установлен на 0 мкМ. Обратите внимание на разные временные рамки для каждой симуляции. Детали модели приведены в дополнительном тексте.

И последнее мнение об измерении колебаний циклических нуклеотидов: исследователи обычно используют высокие концентрации агонистов для запуска производства циклических нуклеотидов. Это часто позволяет измерять (относительно) большие ответы, и ответы также обычно более воспроизводимы, поскольку эксперименты проводятся значительно выше ЕС ₅₀ для продукции циклических нуклеотидов. Хотя это может позволить распутать потенциально сложные взаимодействующие пути, это может быть нефизиологическим и, что важно, может вызывать затухающие выбросы или переходные ответы из-за регуляции с обратной связью в сигнальных системах.Таким образом, необходимо тщательное титрование для оценки содержания информации в физиологических сигналах.

Зависящие от частоты нижележащие эффекторы.

Хотя появляется все больше свидетельств того, что сигналы циклических нуклеотидов колеблются, по крайней мере, при определенных экспериментальных условиях, неясно, как эти колебания интерпретируются нижестоящими эффекторами. Ранее мы использовали моделирование каналов CNG и PKA, чтобы изучить, как каждый эффектор будет реагировать на колебания цАМФ (Rich and Karpen, 2002).Мы заметили, что каналы CNG будут точно воспроизводить быстрые колебания цАМФ (T = ~ 2 с). Моделирование также показало, что активность PKA будет отслеживать медленные колебания цАМФ (T = ~ 1 мин). Однако по мере уменьшения периода колебаний активация PKA достигала плато, в основном из-за медленной реассоциации каталитических и регуляторных субъединиц. Чжан и его коллеги использовали математические модели колебательных контуров и пришли к аналогичному выводу (Ni et al., 2011). Моделирование, проведенное обеими группами, показало, что уровень активации PKA был пропорционален частоте и рабочему циклу колебаний.Таким образом, определенный уровень активности PKA может поддерживаться за счет изменения частоты и рабочего цикла колебаний цАМФ, а не за счет поддержания стабильных внутриклеточных концентраций цАМФ. Точно так же кажется вероятным, что положительная обратная связь, обеспечиваемая аутофосфорилированием PKG, позволит частоте и рабочему циклу колебаний cGMP определять уровень активности PKG.

Цифровое кодирование информации в сигналах циклических нуклеотидов.

До сих пор мы обсуждали сильные и слабые стороны современных циклических нуклеотидных зондов при их использовании для измерения локализованных и колеблющихся сигналов (пространственное и частотное кодирование).Мы кратко обсудим третий механизм, с помощью которого информация может быть закодирована в сигналах вторичных мессенджеров: цифровое кодирование. Цифровое кодирование — это просто комбинация набора включенных и выключенных сигналов. Например, рассмотрим случай с тремя сигналами: цАМФ, цГМФ и Ca ²⁺ . Информация, содержащаяся в сигнале, в котором цАМФ включена (выше порога), цГМФ выключена и Ca ²⁺ выключена, отличается от информации, содержащейся в сигнале, в котором цАМФ включен, цГМФ выключен и Ca ²⁺ включен.Информативность 2 ^N , где N — количество сигналов (в данном случае N = 3).

Биология редко бывает такой простой. Эффекторов может быть несколько, например PKA и Epac. Эти эффекторы имеют различное сродство к цАМФ, и, таким образом, могут быть три состояния: выключено (при котором уровни цАМФ недостаточно высоки, чтобы существенно активировать ПКА), низкое (при котором уровень цАМФ достаточно высок, чтобы существенно активировать ПКА, но не Epac) и высокий (при котором уровни цАМФ достаточно высоки, чтобы существенно активировать как PKA, так и Epac).Также может быть несколько входов для одного сигнального пути, например опосредованная адреналином активация β ₂ -адренергических рецепторов и опосредованная PGE ₂ активация рецепторов EP2. Оба этих входа вызывают увеличение цАМФ; однако информация, содержащаяся в каждом сигнале, может быть аддитивной или просто различной. Таким образом, может быть информация, закодированная в комбинации включенных или выключенных сигналов. Цифровое кодирование информации также может работать в сочетании с пространственным и частотным кодированием.Таким образом, чтобы расшифровать информацию, закодированную в сигналах циклических нуклеотидов, мы должны одновременно отслеживать другие внутриклеточные сигналы, такие как Ca ²⁺ . Самые современные измерения — это, прежде всего, зонды на основе флуоресценции и FRET. Как мы можем количественно измерить сигналы от нескольких зондов на основе флуоресценции и FRET в клетках и тканях?

Гиперспектральная визуализация и анализ сигналов циклических нуклеотидов.

Одним из многообещающих подходов к одновременному измерению нескольких внутриклеточных сигналов является гиперспектральная визуализация и анализ.Подходы к гиперспектральной визуализации были разработаны Министерством обороны и НАСА для решения проблем дистанционного зондирования, связанных со спутниковой визуализацией. Эти подходы использовались для изучения биологических систем и передачи сигналов вторичных мессенджеров (Leavesley et al., 2013; Rich et al., 2013; Woehler, 2013). Гиперспектральные подходы позволяют измерять спектр излучения флуоресценции образца, обеспечивая точное обнаружение и количественную оценку множества уникальных спектральных характеристик, например.g., спектры излучения CFP, YFP и Hoechst 33342 (ядерный краситель) внутри клеток и тканей. Таким образом, гиперспектральные подходы хорошо подходят для одновременного мониторинга флуоресцентного излучения нескольких зондов (Leavesley et al., 2013; Rich et al., 2013). Компромисс при использовании коммерчески доступных спектральных реализаций заключается в снижении временного разрешения. Например, акустооптические перестраиваемые фильтры (AOTF) ослабляют свет на 80%, и требуется длительное время сбора данных. Недавние достижения в технологии фильтров ослабляют свет всего на 5%, что позволяет быстрее получать изображения (Favreau et al., 2013). Наконец, следует также отметить, что даже с развитием технологий выбор системы микроскопа, наиболее подходящей для гиперспектральной визуализации, не всегда прост (Annamdevula et al., 2013), и может потребоваться спектральная калибровка (Leavesley et al., 2012). ).

Другим аспектом интерпретации сигналов циклических нуклеотидов является беспристрастный анализ данных. Традиционные подходы к анализу изображений требуют от исследователей выбора областей интереса (ROI) для автоматического анализа интенсивности излучения.Это стало предметом разногласий, поскольку ручной выбор областей интереса может непреднамеренно исказить интерпретацию данных, особенно при исследовании сигналов от интактных тканей, а не клеточных монослоев. Недавние достижения в области автоматизированного анализа изображений преодолевают это ограничение, выбирая ROI на основе обнаружения событий выше шумовых порогов или геометрических ограничений (Francis et al., 2012; Leavesley et al., 2013). Таким образом, ROI могут быть определены количественно определенным образом, пороговые значения отклика сигнала могут быть установлены на основе базовых уровней шума, а сигналы выше базового уровня шума могут быть затем автоматически идентифицированы и проанализированы.

Большое будущее для расшифровки содержания информации в сигналах циклических нуклеотидов

За последние пятнадцать лет был достигнут значительный прогресс в измерении сигналов циклических нуклеотидов. Здесь мы обсудили несколько сенсоров циклических нуклеотидов, выделили их сильные и слабые стороны и суммировали три механизма кодирования информации внутриклеточных сигналов. И хотя все флуоресцентные зонды на основе белков имеют ограничения с точки зрения динамического диапазона и буферизации сигналов, последнее поколение зондов имеет увеличенный диапазон, и подходы гиперспектральной визуализации могут использоваться для улучшения отношения сигнал/шум флуоресценции и FRET. измерения.Эти достижения должны позволить обнаруживать и количественно определять локализованную динамику циклических нуклеотидов как в препаратах отдельных клеток, так и в тканях. Гиперспектральная визуализация также позволяет измерять несколько зондов для одновременного отслеживания колебаний нескольких внутриклеточных сигналов. Автоматический анализ изображений предоставляет набор инструментов, которые позволяют исследователям беспристрастно анализировать данные. Эти данные можно использовать для проверки и проверки математических описаний сигнальных систем в клетках и тканях.В свою очередь, математические модели могут быть использованы для управления нашим экспериментальным планом. За последнее десятилетие технологии, необходимые для декодирования информационного содержания внутриклеточных сигналов, развились до такой степени, что мы можем приступить к расшифровке потока информации между клетками и окружающей их средой.

Эта серия «Перспективы» включает статьи Карпена, Капилоффа и др., Конти и др., а также Сосермана и др.

Приведены уравнения, описывающие разделенные и осциллирующие сигналы циклических нуклеотидов.В таблице S1 представлены значения параметров, описания, начальные условия и ссылки, из которых значения параметров были получены или оценены для компартментальных моделей, описывающих внутриклеточное распределение циклических нуклеотидов. В таблице S2 представлены значения параметров, описания, начальные условия и ссылки, из которых были получены или оценены значения параметров для моделей, описывающих колебательные сигналы cGMP. Дополнительный онлайн-материал доступен по адресу http://www.jgp.org/cgi/content/full/jgp.201311095/DC1.

Что делает трубопроводный газ для приготовления пищи таким удобным?

В то время как цели и амбиции правительства побудили энергетические компании поставлять природный газ на более широкую базу, каковы преимущества, которые побуждают людей делать выбор в пользу трубопроводных газопроводов? Мы поговорили с 5 людьми из разных слоев общества, которых объединяет одно — все они используют PNG. Вот что они сказали о переходе с газовых баллонов на газопроводы:

Самин Сайеда, писатель, житель Дели

Ранджана Ниджхаван, домохозяйка, жительница Гуруграма
Использование PNG в течение 4 лет

Эрик Лобо, специалист по СМИ, житель Мумбаи
Использование PNG в течение 5 лет

Сиддхарт Шридхар, специалист по рекламе, житель Мумбаи
Использование PNG в течение 6+ лет

Р. Сакунтала, учитель на пенсии, житель Мумбаи
Использование PNG в течение 2 лет

Все эти истории убедительно доказывают, что PNG является наиболее предпочтительной формой газа для приготовления пищи. Еще одним большим преимуществом использования PNG является то, что природный газ оказывает меньшее воздействие на окружающую среду по сравнению с обычными видами топлива. Но необходимо задать вопрос: что потребуется для более широкого перехода на этот безопасный, надежный и надежный вид топлива? Индия наращивает инвестиции в городской газовый сектор, чтобы значительно расширить сферу применения КПГ и ПНГ. И его потребность в природном газе, кажется, утоляется благодаря лидерам энергетики, таким как ExxonMobil, которые ищут инновационные способы расширения доступа Индии к природному газу.

Ранее в этом году ExxonMobil объявила о сотрудничестве с ведущим поставщиком газа в Индии GAIL и местной энергетической компанией Indian Oil. ExxonMobil, ведущий новатор в области экологически чистых энергетических решений, вот уже два десятилетия помогает Индии расширить доступ к газовой энергии. Увеличение потребления PNG станет важным шагом, среди прочего, к увеличению доли природного газа на энергетическом рынке Индии и снижению выбросов углерода в стране.

С такими энергетическими игроками, как ExxonMobil, стремящимися увеличить производство этого экологически чистого топлива, ожидается рост PNG.А учитывая, насколько люди довольны этим источником, кажется, что это беспроигрышный вариант для всех. Как показывают отзывы пользователей, выбор PNG вместо газовых баллонов не только повышает удобство, снижает затраты и повышает безопасность, но также предоставляет пользователям выбор в пользу окружающей среды, который необходимо делать в более широком масштабе.

Exxon Mobil Corporation имеет многочисленные филиалы; для удобства и простоты в этой статье термин «ЭксонМобил» используется как сокращенное обозначение одной или нескольких из этих дочерних компаний или аффилированных лиц.

Акронимы и сокращения | Voal.com

74