Описание

Съемник шаровых опор и рулевых тяг

• A, мм: 19
• B, мм: 60 — 80

Сертификаты

Статьи о товаре

• Лучший способ демонтажа шаровых опор 7 Октября 2013

  Шаровые опоры, несмотря на свои небольшие размеры, являются одной из важнейших составляющих подвески. В рабочем состоянии эти детали надежно запрессованы, поэтому их ремонт или замена, неизбежно требующие демонтажа, крайне затруднительны без специализированного инструмента — съемника шаровых опор.

Цены и наличие товара во всех магазинах и складах обновляются 1 раз в час. При достаточном количестве товара в нужном вам магазине вы можете купить его без предзаказа.

Цена в магазинах — розничная цена товара в торговых залах магазинов без предварительного заказа.

Срок перемещения товара с удаленного склада на склад интернет-магазина.

Представленные данные о запчастях на этой странице несут исключительно информационный характер.

1463f32727442e617c6faf11c4ef01ed

Добавление в корзину

Код для заказа:

Доступно для заказа:

Кратность для заказа:

Отменить

Товар успешно добавлен в корзину

!

В вашей корзине на сумму

Закрыть

Вице-президент Канадской телевизионной спортивной сети TSN Пол Грэм высоко оценил ход строительства ледовой арены в Новосибирске

В ходе рабочего визита Пол Грэм и Артур Ковтуненко ознакомились с основными инфраструктурными объектами, предназначенными для приема гостей первенства.  

Основным объектом визита стала строительная площадка многофункциональной ледовой арены. Вместе с руководителями ГКУ НСО «Арена», АНО «Исполнительная дирекция МЧМ-2023», представителями министерства физической культуры и спорта региона гости на месте обсудили, как будет организована телевизионная трансляция хоккейных матчей чемпионата мира, которые будут проходить в Новосибирской области, а также техническое оснащение ледовой арены в Новосибирске. В частности, ознакомились с расположением помещений полустационарного телевизионного транспункта (ПСТТП – это помещение, оборудованное силовыми и другими разъемами, куда сходится кабельная система стадиона, парковки для передвижной телевизионной станции, комментаторских позиций и камер.

Пол Грэм отметил, что ему понравилось, как идет строительство ледовой арены. «В Северной Америке мы проинспектировали более 30 таких арен. И я могу сказать, что у вас строительство идет на очень высоком уровне. Мы любим молодежные чемпионаты мира, для Канады – это очень важное событие. Конечно, строительство еще идет, много еще предстоит сделать. Думаю, что в следующий наш визит мы увидим уже более отчетливую картинку. Но уже сейчас могу отметить, что у вас очень передовой подход в плане размещения комментаторских кабин. Очень часто возможности вещания на аренах осуществляется только с одной стороны, а у вас с двух. Это очень правильный подход», – сказал он.

По словам Пола Грэма, на матчи молодежного чемпионата мира приедут более 50 человек – телевизионщиков, а также порядка трех тысяч болельщиков.

Как сообщил генеральный директор Исполнительной дирекции МЧМ-2023 Владимир Тукмачев, это первый официальный международный визит в Новосибирскую область в рамках подготовки к чемпионату мира по хоккею. «В рамках федерального плана подготовки и проведения МЧМ в Новосибирске нам должны в ближайшее время сбросить план – график посещения нашего региона иностранными делегациями. На прошлой неделе Губернатор Новосибирской области подписал региональный план подготовки к проведению чемпионата, который идет в унисон с федеральным планом, поэтому можем говорить, что нормативно-правовая база уже подготовлена»,- сказал он.

Ранее министр физической культуры и спорта региона Сергей Ахапов говорил, что ввод этого крупного спортивного объекта в эксплуатацию ждут не только профессиональные спортсмены, но и все любители спорта. Чуть больше, чем через год ледовая арена откроет двери, и станет не просто домашней площадкой для хоккейной команды «Сибирь», но и площадкой, где соберутся все любители спорта. 
Добавим, что уже завтра Пол Грэм и Артур Ковтуненко с аналогичным визитом посетят Омскую область.

Николай Линченко проверил ход строительства социальных объектов Курортного и Приморского районов

Вице-губернатор Санкт‑Петербурга Николай Линченко совместно с председателем Комитета по строительству Игорем Креславским и управляющим СПб ГКУ «Фонд капитального строительства и реконструкции» Арзу Фаталиевым провели рабочий объезд социальных объектов Курортного и Приморского районов, строительство которых завершится в этом году.  

Вначале участники объезда проверили ход строительства здания общежития квартирного типа для сотрудников СПб ГБУЗ «Городская больница №40 Курортного района» по адресу: пос. Репино, Приморское шоссе, западнее д. 423, к. 2. Его строительная готовность составляет 75%, работы выполняет ООО «Сотэкс». В настоящее время ведутся отделочные работы в квартирах и местах общего пользования, идет монтаж кронштейнов и направляющих лифтов, вентилируемых фасадов, дверей и ограждений балконов. Также идет доставка оборудования, монтаж механизмов розеток, выключателей и сетей связи, а также благоустройство.

Второй точкой объезда стала общеобразовательная школа № 434 на улице Мосина, д.63, литера А. Реконструкция школы со строительством пристройки для размещения бассейна ведется ООО «СтройСиндикат». На данном этапе на объекте работают 208 специалистов. Ведутся работы по внутренним и наружным инженерным системам, по благоустройству территории, идет поставка и монтаж монтируемого оборудования. Общая готовность здания составляет 81%. Планируемый ввод в эксплуатацию – до 15.08.2021.

Кроме того, в рамках объезда были осмотрены две школы Приморского района. Первая из них на Шуваловском проспекте рассчитана на 550 мест. Строительство ведёт ООО «ИНТЕКС». Подрядчик отчитался о готовности объекта на 97%: завершаются работы по внутренней отделке помещений, благоустройству, промывке системы отопления и пуско-наладочные работы инженерных систем.

Вторая школа на Комендантском пр. рассчитана на 550 мест. Строительство ведёт ООО «ЭЛИНАЛЬФА». Сейчас на объекте выполняются работы по устройству полов, штукатурке стен, монтажу внутренних сетей отопления, вентиляции, электроснабжения, водопровода, канализации, сетей связи. Ведутся работы по финишной отделке помещений и благоустройству территории. На сегодняшний день степень строительной готовности объекта составляет 82%.

Подводя итоги рабочего выездного совещания, Николай Линченко поручил подрядчикам максимально ускорить ход работ, а Комитету по строительству и СПб ГКУ «Фонд капитального строительства и реконструкции» контролировать своевременность их исполнения.

Ход работ по реконструкции автомобильного пункта пропуска Верхний Ларс обсудили в рамках выездного рабочего совещания

30 апреля  на строительной площадке автомобильного пункта пропуска через госграницу Верхний Ларс директор Департамента государственной политики в области обустройства пунктов пропуска через государственную границу Минтранса России Михаил Кокаев совместно с заместителем Председателя Правительства  Республики Северная Осетия – Алания Игорем Касабиевым, руководителем ФГКУ Росгранстрой Виталием Шишмарёвым, представителями таможенной службы и подрядной организации, выполняющей работы по реконструкции пункта пропуска,  обсудили темпы модернизации объекта и вопросы межведомственного взаимодействия и в целях обеспечения стабильного функционирования погранперехода в период его реконструкции.

Справка: 

Реализация проекта реконструкции МАПП Верхний Ларс – долгожданное событие для региона. Расположенный на Военно-Грузинской дороге единственный действующий сухопутный пункт пропуска на российско-грузинской границе Верхний Ларс входит в створ международного транспортного коридора «Север-Ю» и является связующим звеном, через которое пролегает один из древнейших торговых путей из России в страны Закавказья и Ближнего Востока. Модернизация пункта пропуска будет способствовать развитию этого транспортного узла и укреплению экономики региона. 

Ежегодный рост грузоперевозок и пассажиропотока, сложный рельеф местности и непростые климатические условия являются причинами образования очередей на подъезде к пункту пропуска. Реконструкция погранперехода призвана изменить ситуацию. 

Модернизация инфраструктуры пункта пропуска позволит разделить потоки по видам транспорта и направлениям движения, увеличить количество полос движения до 39 и число накопительных стоянок до 75 мест, сократить время проведения контрольных процедур, а значит повысить скорость пересечения границы и доставки грузов.

Строительно-монтажные работы в пункте пропуска начались в феврале этого года. Работы ведутся без отставания от графиков. Их завершение намечено на конец2022 года. По итогам реконструкции пропускная способность погранперехода увеличится в 9,5 раз до 3800 транспортных средств в сутки.

Возврат к списку

Отобразить столбцы свертки, отображающие ход выполнения, количество или итоги — Azure Boards

• 05/21/2021
• Чтение занимает 2 мин

В этой статье

Azure Boards | Azure DevOps Server 2020

Столбцы свертки позволяют просматривать индикаторы выполнения или итоговые значения для числовых полей или элементов-потомков в иерархии. Потомки соответствуют всем дочерним элементам в иерархии. Можно добавить один или несколько столбцов свертки в невыполненную работу по продукту или портфелю. Сведения о связывании рабочих элементов в иерархии см. в разделах связывание, трассировка и управление зависимостями, ссылки на рабочие элементы типа «родители-потомки».

Например, в этом примере мы отображаем ход выполнения рабочих элементов , которые отображают индикаторы выполнения для ascendских рабочих элементов на основе процента закрытых элементов-потомков. Элементы-потомки для ситуаций включают все дочерние компоненты, а также их дочерние или общие рабочие элементы. Элементы-потомки для функций включают все дочерние пользовательские истории и их дочерние рабочие элементы.

Важно!

Данные свертки поддерживают индикаторы выполнения, количество рабочих элементов или суммы числовых полей в проекте. Дочерние элементы, которые связаны с другим проектом, не учитываются при вычислении родительской свертки. Кроме того, ссылки на тестовые случаи и артефакты тестирования также не включаются в вычисление свертки. Эти элементы связаны с помощью типов ссылок, относящихся к конкретному тесту.

Примечание

Вы также можете просмотреть сведения о ходе выполнения свертки из новой версии планов доставки, доступных в общедоступном предварительном просмотре для Azure Boards. Этот компонент теперь является частью Azure Boards, а не расширением. Чтобы включить его, см. раздел Управление и включение компонентов и включение новых планов доставки. Дополнительные сведения см. в статье Обзор планов доставки команд.

Предварительные условия

• Данные столбца свертки вычисляются из службы аналитики.

Сводная и иерархическая рабочие элементы

Набор рабочих элементов невыполненной работы по умолчанию, которые поддерживают естественную иерархическую группировку, зависит от процесса, выбранного для проекта. Самый простой способ группирования рабочих элементов в иерархию заключается в их сопоставлении или добавлении к родительскому элементу на доске Канбан. Дополнительные сведения см. в статьях упорядочение невыполненной работы, привязка дочерних рабочих элементов к родителям и функциям и ситуаций на досках Канбан.

На следующем рисунке показана иерархия рабочих элементов невыполненной работы процесса Agile. Каждая команда может настроить способ управления ошибками — на том же уровне, что и пользовательские истории или задачи — , настроив параметр Работа с ошибками .

На следующем рисунке показана базовая иерархия рабочих элементов невыполненной работы по процессу, которая включает в себя ситуаций, проблемы и задачи.

На следующем рисунке показана иерархия рабочих элементов невыполненной работы Scrum Process. Каждая команда может настроить способ управления ошибками на — том же уровне, что и элементы невыполненной работы по продукту — , путем настройки параметра Работа с ошибками .

На следующем рисунке показана иерархия рабочих элементов CMMI Process невыполненной работы. Каждая команда может настроить способ управления ошибками — на том же уровне, что и требования или задачи — , настроив параметр Работа с ошибками .

Открытие невыполненной работы по продукту или портфелю

Каждый пользователь может задать собственные параметры столбцов, которые сохраняются для каждой невыполненной работы в сеансах пользователя.

1. Откройте невыполненную работу по продукту или портфелю. При необходимости включите параметр Показать родительские элементы в параметрах представления. Обратите внимание, что даже если дочерние элементы не перечислены, отображается свертка для них.

   Совет

   Рассмотрите возможность открыть невыполненную работу портфеля и выбрать Просмотр элементов хода выполнения и завершенных дочерних элементов. Таким образом, можно проверить значение состояния элементов по значению свертки.

2. Выберите Параметры столбца или щелкните значок действия, а затем выберите Параметры столбца.

   Совет

   Помните, что выбранные параметры столбцов относятся к выбранному уровню невыполненной работы. Они сохраняются в сеансах до тех пор, пока вы не измените их.

Добавить столбец свертки

1. В диалоговом окне Параметры столбца выберите Добавить столбец свертки, выберите из списка быстрый список, а затем выберите один из параметров в списке.

   Примечание

   Параметры меню зависят от процесса, выбранного для проекта, выбранного уровня невыполненной работы и наличия включенного параметра Показать представление родителей .

2. Выберите из предоставленного меню.

   • Индикатор хода выполнения отображает индикаторы выполнения в зависимости от процента завершенных или закрытых рабочих элементов-потомков.
   • Общее число отображает сумму элементов-потомков или связанных полей элементов-потомков. Итоги предоставляют меру размера компонента или ситуации в зависимости от количества ее дочерних элементов. Например, число задач показывает сумму всех задач, связанных с родительскими элементами. Активное или закрытое состояние игнорируется.

   Например, на следующем рисунке показано количество задач для родительских пользовательских историй — 2 и 4 соответственно. Число задач равно 6 для родительской функции и ситуации.

3. Оставшаяся работа задачи показывает сумму оставшейся работы задач, связанных с родительским элементом.

   Совет

   Напоминание о том, что при закрытии задачи поле Оставшаяся работа устанавливается в нулевое значение.

Состояния аналитики, задержки и ошибок

Данные свертки рассчитываются из службы аналитики. При наличии большого объема данных может возникнуть задержка при отображении сводного показателя. При наведении указателя мыши на значок свертки можно определить состояние данных.

Если при получении данных свертки возникает ошибка, отображается значок сведений и пустые строки. Ошибки указывают на время последнего обновления данных аналитики. Это означает, что службы аналитики по-прежнему обрабатывают внесенные изменения, которые могут повлиять на расчеты свертки. После того как аналитические данные обновлены, столбцы свертки будут обновлены с учетом последних данных.

Дополнительные сведения о службе см. в статье что такое аналитика?.

Изменение порядка столбцов или удаление столбца свертки

Чтобы изменить порядок полей, перетащите поле в нужное место в пределах набора выбранных полей. Чтобы удалить поле, нажмите кнопку .

Свертка пользовательских типов рабочих элементов или настраиваемых полей

При добавлении пользовательского типа или поля рабочего элемента к уровню невыполненной работы можно просмотреть свертку на основе этих параметров. Например, тип запроса клиента добавляется в категорию требования, а количество запросов клиентов показано на следующем рисунке.

1. В диалоговом окне Параметры столбца выберите Добавить столбец свертки, выберите параметр настроить пользовательскую свертку .

2. Выберите нужные параметры в диалоговом окне столбец пользовательской свертки.

3. Нажмите кнопку ОК. и нажмите кнопку ОК , чтобы завершить операции…

   Совет

   При добавлении настраиваемых полей или пользовательских типов рабочих элементов необходимо обновить страницу невыполненной работы, чтобы отразить изменения.

Использование сочетаний клавиш для изменения порядка столбцов, ширины столбцов или сортировки

Изменить порядок столбцов, размер столбцов или параметры сортировки можно с помощью следующих команд клавиатуры:

• Чтобы изменить порядок столбцов, щелкните поле и перетащите его в новое место.
• Чтобы изменить размер столбца, выберите разделитель столбцов справа от поля и перетащите его в новое место.

Похожие статьи

Продолжительный рабочий день увеличивает количество смертей от болезней сердца и инсульта: ВОЗ, МОТ

Продолжительный рабочий день привел к 745 000 смертей от инсульта и ишемической болезни сердца в 2016 году, что на 29 процентов больше, чем в 2000 году, согласно последним оценкам Всемирного банка. Организация здравоохранения и Международная организация труда опубликовали сегодня журнал Environment International .

В первом глобальном анализе потерь жизни и здоровья, связанных с продолжительной работой, ВОЗ и МОТ подсчитали, что в 2016 году 398000 человек умерли от инсульта и 347000 человек умерли от сердечных заболеваний в результате работы по крайней мере 55 часов в неделю.В период с 2000 по 2016 год количество смертей от сердечных заболеваний в результате продолжительной работы увеличилось на 42%, а от инсульта — на 19%.

Это бремя болезней, связанных с работой, особенно велико для мужчин (72% смертей приходятся на мужчин), людей, живущих в регионах Западной части Тихого океана и Юго-Восточной Азии, а также работников среднего и пожилого возраста. Большинство зарегистрированных смертей приходилось на людей в возрасте 60-79 лет, которые работали по 55 часов или более в неделю в возрасте от 45 до 74 лет.

Поскольку известно, что на сверхурочную работу приходится около одной трети общего расчетного бремени болезней, связанных с работой, она признана фактором риска с наибольшим бременем профессиональных заболеваний. Это сдвигает мышление в сторону относительно нового и более психологического профессионального фактора риска для здоровья человека.

В исследовании сделан вывод о том, что работа 55 или более часов в неделю связана с примерно на 35% более высоким риском инсульта и на 17% более высоким риском смерти от ишемической болезни сердца по сравнению с работой 35-40 часов в неделю.

Кроме того, количество людей, работающих сверхурочно, увеличивается и в настоящее время составляет 9% от общей численности населения во всем мире. Эта тенденция подвергает еще больше людей риску потери трудоспособности и преждевременной смерти.

Новый анализ появился, когда пандемия COVID-19 проливает свет на управление рабочим временем; пандемия ускоряет развитие событий, которые могут способствовать тенденции к увеличению рабочего времени.

«Пандемия COVID-19 существенно изменила способ работы многих людей», — сказал д-р Тедрос Адханом Гебрейесус, Генеральный директор ВОЗ.«Удаленная работа стала нормой во многих отраслях, часто стирая границы между домом и работой. Кроме того, многие предприятия были вынуждены свернуть или закрыть операции, чтобы сэкономить деньги, а люди, которые все еще получают заработную плату, в конечном итоге работают дольше часов. Никакая работа не стоит риска инсульта или сердечного приступа. Правительства, работодатели и работники должны работать вместе, чтобы согласовать ограничения для защиты здоровья работников ».

«Работа 55 и более часов в неделю — серьезная опасность для здоровья», — добавила д-р Мария Нейра, директор Департамента окружающей среды, изменения климата и здоровья Всемирной организации здравоохранения.«Пришло время всем нам, правительствам, работодателям и сотрудникам осознать тот факт, что продолжительный рабочий день может привести к преждевременной смерти».

Правительства, работодатели и работники могут принимать следующие меры для защиты здоровья работников:

• Правительства могут вводить, применять и обеспечивать соблюдение законов, постановлений и политик, запрещающих обязательную сверхурочную работу и обеспечивающих максимальные ограничения рабочего времени;
• двусторонние или коллективные договоры между работодателями и ассоциациями работников могут предусматривать более гибкое рабочее время, в то же время согласовывая максимальное количество рабочих часов;
• сотрудников могут разделить рабочее время, чтобы количество отработанных часов не превышало 55 и более часов в неделю.

Примечание для редакторов:

Для этого исследования были проведены два систематических обзора и метаанализа последних данных. Были синтезированы данные 37 исследований ишемической болезни сердца, охвативших более 768 000 участников, и 22 исследований инсульта, охвативших более 839 000 участников. Исследование охватывало глобальный, региональный и национальный уровни и основывалось на данных более чем 2300 опросов, собранных в 154 странах с 1970 по 2018 год.

Продолжительное рабочее время может увеличить риск инсульта, вот что может помочь

Некоторые из наиболее успешных предпринимателей, в первую очередь Илон Маск и Билл Гейтс, хвалят долгие часы, которые они проводят в офисе, особенно в начале своей карьеры.Но новое исследование показывает, что регулярная продолжительная работа может увеличить риск инсульта.

Исследование, опубликованное в понедельник в Журнале Американской кардиологической ассоциации, показало, что работа 10 и более часов в день, всего 50 дней в году, может увеличить риск инсульта почти на треть (29%). Это так же просто, как работать с 8:00 до 18:00 примерно раз в неделю.

А работа 10 или более часов в день, 50 дней в году в течение десяти лет может повысить риск инсульта до 45%.

Для исследования исследователи проанализировали данные о продолжительности рабочего времени более 143 500 человек во Франции с 2012 года.Из проанализированных 29% респондентов сообщили, что работали более 10 часов в день более 50 дней в году, а 10% сообщили, что работали в таком количестве в течение 10 и более лет. (Исследователи говорят, что они исключили субъектов, у которых был инсульт в течение пяти лет после их первого зарегистрированного воздействия на работу, и участники должны были иметь как минимум шестимесячный опыт работы, чтобы быть включенными.)

Интересно, что когда исследователи детализировали данные, белый По словам исследователей, воротнички в возрасте до 50 лет имели еще более высокий риск инсульта, в то время как у тех, кто занимал более высокие должности (включая генеральных директоров, владельцев, менеджеров и даже фермеров), риск инсульта был ниже.Однако разницы между мужчинами и женщинами не было.

Участники, у которых были плохие условия труда (например, работа с высоким уровнем стресса или работа в непиковые часы, например, ночные смены), также имели более высокий риск инсульта, Алексис Деската, исследователь из Парижской больницы, Университета Версаля и Анже и Французского национального института медицины Компания Health and Medical Research (Inserm), проводившая исследование, сообщает CNBC Make It. А привычки получателей в еде, сне и физических упражнениях повлияли на их риски.

Теория состоит в том, что долгие часы работы повышают уровень стресса, согласно Дескате, что может привести к инсульту и ухудшается, когда кто-то не заботится о себе.

Предыдущие исследования также показали, что сотрудники, которые работают сверхурочно, имеют более слабое психическое здоровье, повышенный уровень тревожности и депрессии, а также более низкое качество сна, что может способствовать более высокому риску инсульта.

Хорошая новость в том, что есть вещи, которые можно сделать, чтобы уменьшить опасность.

Что делать (особенно, если долгие часы — это норма)

Очевидным решением было бы работать меньше, но это не всегда реально; почти четыре из 10 СШАВзрослые сказали, что они работают не менее 50 часов в неделю, согласно опросу Gallup 2014 года.

Действительно, доктор Филип Стиг, нейрохирург из Центра мозга и позвоночника Weill Cornell, рассказал CNBC Make It, что люди обычно слышат статистику и думают: «Боже мой, моя работа полна стресса, и я работаю много часов, мне нужно другая работа «.

Но он говорит, что это не решение. «Люди не берут на себя ответственность за основные профилактические мероприятия», — говорит Стиг. «Некоторые вещи [и работа] вызывают стресс.Мы все это понимаем. Итак, люди должны делать то, что уравновешивает этот стресс ».

Стиг говорит, что для начала выясните, какие повседневные задачи на работе вызывают у вас наибольший стресс, а затем найдите решения, чтобы облегчить или компенсировать их. Вот три эффективных.

Медитируйте

Стейг говорит, что один из способов смягчить стресс — это уделить 20 минут (все сразу или 10 минут дважды в день) на медитацию в тихой комнате, на работе, до или после смены. было показано, что практика помогает удерживать уровень стресса у рабочих под контролем.

Фактически, миллиардер Рэй Далио — приверженец медитации: «Это помогает замедлить процесс, чтобы я мог действовать спокойно, даже перед лицом хаоса, как ниндзя в уличной драке», — пишет Далио в своей книге: «Принципы». Он даже считает, что его практика посредничества помогла ему вернуться из финансового краха в начале карьеры.

Правильно питайтесь и занимайтесь спортом

И Стейг, и Деската говорят, что если вы много работаете, важно поддерживать здоровую диету и заниматься физическими упражнениями.

Стейг рекомендует своим пациентам диету средиземноморского типа, которая состоит из фруктов, овощей, рыбы, бобовых и оливкового масла с умеренными порциями молочных продуктов и мяса. Он также говорит, что можно выпивать два стакана красного вина в день, но не больше, поскольку употребление алкоголя может вызвать стресс для организма.

Ричард Брэнсон говорит, что регулярные упражнения делают его счастливым, здоровым и продуктивным: «Я люблю ухаживать за телом. Если я чувствую себя хорошо, я могу добиться чего угодно», — сказал ранее CNBC Make It.

Высыпайтесь ночью

Dr.Ребекка Роббинс, научный сотрудник Langone Health Нью-Йоркского университета, говорит, что работники, которые не спят рекомендованные семь-девять часов в сутки, обычно более тревожны и подавлены на работе, что может вызвать проблемы со здоровьем.

Стиг также согласен с тем, что недостаточный отдых может увеличить вероятность инсульта.

Знайте свои номера

Стиг рекомендует всем, особенно трудоголикам, регулярно посещать своего врача, чтобы контролировать свое кровяное давление и уровень холестерина, чтобы убедиться, что все их «маркеры стресса» находятся на низком уровне.»

Нравится эта история? Нравится CNBC Make It на Facebook .

Не пропустите: Сидеть на работе может быть не так плохо для вас, как сидеть и смотреть телевизор

Как миллиардер Рэй Далио использовал медитацию мантры, чтобы вернуться из финансового краха

Продолжительность рабочего времени, связанная с повышенным риском инсульта — ScienceDaily

У людей, которые работали сверхурочно, было больше риск инсульта, особенно если они проработали эти часы в течение 10 или более лет, согласно новому исследованию, опубликованному в журнале Stroke Американской кардиологической ассоциации.

Исследователи проанализировали данные CONSTANCES, французской исследовательской группы, основанной на населении, начатой ​​в 2012 году, на предмет информации о возрасте (18-69), поле, курении и продолжительности работы, полученной из анкет 143 592 участников. Факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний и предыдущие случаи инсульта были отмечены в ходе отдельных медицинских интервью.

Исследователи обнаружили:

• всего 1224 участника перенесли инсульт;
• 29%, или 42 542, сообщили о сверхурочной работе;
• 10%, или 14 481, сообщили о сверхурочной работе в течение 10 и более лет; и
• участников, работающих сверхурочно, имели на 29% больший риск инсульта, а те, кто работал сверхурочно в течение 10 лет или более, имели на 45% больший риск инсульта.

Продолжительное рабочее время определяется как работа более 10 часов в течение не менее 50 дней в году. Работники, занятые неполный рабочий день, и те, кто перенес инсульт перед сверхурочной работой, были исключены из исследования.

«Связь между 10-летним сверхурочным рабочим днем ​​и инсультом казалась более сильной для людей в возрасте до 50 лет», — сказал автор исследования Алексис Деската, доктор медицины, доктор философии, исследователь Парижской больницы, Университета Версаля и Анже, а также Французский национальный институт здоровья и медицинских исследований (Inserm).»Это было неожиданно. Для изучения этого открытия необходимы дальнейшие исследования.

«Я также хотел бы подчеркнуть, что многие поставщики медицинских услуг работают намного больше, чем определение продолжительного рабочего дня, и также могут иметь более высокий риск инсульта», — сказал Деската. «Как клиницист, я посоветую своим пациентам работать более эффективно и планирую следовать своим советам».

Предыдущие исследования отметили меньшее влияние продолжительного рабочего дня на владельцев бизнеса, генеральных директоров, фермеров, профессионалов и менеджеров. Исследователи отметили, что это может быть связано с тем, что эти группы обычно имеют большую свободу принятия решений, чем другие работники.Кроме того, другие исследования показали, что ненормированные смены, работа в ночное время и рабочая нагрузка могут быть причиной нездоровых условий труда.

История Источник:

Материалы предоставлены Американской кардиологической ассоциацией . Примечание. Содержимое можно редактировать по стилю и длине.

Рабочий ход после связывания миозин-нуклеотидных комплексов с актином

Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003 27 мая; 100 (11): 6434–6439.

Биофизика

Центр Рэндалла, Королевский колледж, Лондон SE1 1UL, Соединенное Королевство

Сообщение Эдвина В.Тейлор, Чикагский университет, Чикаго, Иллинойс, 4 апреля 2003 г.

Abstract

В течение многих лет было известно, что миозин прочно связывается с актином, но было невозможно разработать эксперимент с мышечным волокном, чтобы определить, связана ли эта энергия связывания непосредственно с рабочим ходом цикла поперечного мостика актомиозина. Решение вопроса на уровне одной молекулы с помощью оптического пинцета позволяет решить проблему.Мы сравнили рабочий ход связывания четырех комплексов миозина (миозин, миозин-АДФ, миозин-пирофосфат и миозин-аденил-5’илимидодифосфат) с таковым, наблюдаемым при гидролизе АТФ. Ни один из четырех не показал значительного отличия рабочего хода от нуля. Рабочий ход (5,4 нм) наблюдался только с АТФ, что указывает на то, что другие состояния связываются с актином в конформации, подобной строгости, и что продукты миозина (M.ADP.P _i ), состояние, которое связывается с актином во время Активность АТФазы связывается в другой, доинсультной конформации.Мы заключаем, что миозин, будучи диссоциированным от актина, должен иметь возможность принимать по крайней мере две механические конформации, и показываем, что наши результаты согласуются с этими конформациями, соответствующими двум состояниям, характеризуемым с высоким разрешением, которые обычно называют открытые и закрытые карманы связывания нуклеотидов.

Данные электронных микрофотографий для различных конформаций миозина привели к гребной модели действия поперечного мостика актомиозина (AM) (1, 2), в которой миозин связывается с актином в одной конформации, подвергается рабочему удару и отделяется во второй конформации.Схема Лимна – Тейлора (3), описывающая биохимическую кинетику AM, обеспечивает естественное соответствие механической модели (). Отщепленные продукты миозина (M.ADP.P _i ) связаны с актином, и рабочий ход произошел в связи с высвобождением продукта. Связывание АТФ облегчало диссоциацию актина, и его гидролиз происходил при диссоциации миозина. Модель постулировала, что стадия гидролиза связана с разделением головы из структуры после силового удара обратно в форму предпускового удара, хотя в то время не было никаких доказательств на этот счет.Основываясь на наблюдении, что отслоенные состояния, миозин-АТФ и M.ADP.P _i , ведут себя аналогичным образом в отношении связывания актина, Эйзенберг и его сотрудники (4) отдали предпочтение модели, в которой существует единственная отсоединенная конформация. миозина.

Выравнивание биохимических состояний Лимна – Тейлора с перекрестным циклом. Pr = Продукты, ADP.P.

Измерение константы связывания АТФ (5) и константы связывания актина (6) были важными шагами, позволившими выяснить основную энергетику механизма AM.Большая часть свободной энергии гидролиза АТФ связана со связыванием актина с состоянием M.ADP.P _i и формированием состояния строгости AM (7), части схемы, которая должна охватывать рабочий ход. Состояние миозина в отсутствие нуклеотидов еще более плотно связывается с актином, и если именно энергия связывания AM приводит в действие механическое действие, можно предположить, что рабочий удар также будет результатом связывания миозина с актином. Эта идея согласуется с взглядами Айзенберга (4) и модели сжатия «3G» (8).В последней модели все состояния миозина существуют в одной конформации миозина, и связывание актина происходит в два этапа, первый из которых представляет собой связывание и образование слабосвязанного комплекса (состояние A), а второй — превращение в прочно связанный комплекс (R штат). Естественно было предположить, что переход от слабого к сильному (или от A к R) соответствует рабочему ходу.

В последние годы схема, тесно связанная со схемой Lymn и Taylor (3), была разработана на основе кристаллических структур субфрагмента 1 миозина (S1).При кристаллизации в различных нуклеотидных состояниях являются общими две формы, которые различаются по ряду областей, включая карман связывания нуклеотидов, область переключателя 2 и щель между верхним и нижним доменами 50 кДа. Эти две формы обычно обозначаются на основе состояния нуклеотид-связывающего кармана как закрытый и открытый. Переход от закрытой формы к открытой связан с движением плеча рычага и с рабочим ходом. Переход от открытого состояния к закрытому происходит перед стадией гидролиза и был связан с перерисовкой (9).

Эти модели могут быть протестированы непосредственно на уровне отдельной молекулы миозина с помощью оптического пинцета, чтобы удерживать актиновую нить в натянутом состоянии между двумя захваченными шариками и подавать ее молекуле миозина на третьей фиксированной шарике (10). Смещения актиновых бусинок «гантели» отслеживаются и используются для обнаружения событий прикрепления; разница между средними смещениями в свободном и связанном периодах дает рабочий ход миозина, который в условиях оборота АТФ составляет ≈5–6 нм. Чтобы выделить рабочий инсульт в биохимическом цикле, мы исследовали связывание миозина и миозин-нуклеотидных комплексов в отсутствие АТФ, где переходы ограничиваются связыванием актина и потерей нуклеотида.Хотя эти переходы обратимы и из гантели нельзя извлечь сетку, любой связанный рабочий ход все равно будет обнаружен, как описано в «Материалы и методы» . Важно подчеркнуть, что наблюдаемый рабочий ход отражает разницу в ориентации связанного состояния и диссоциированного состояния в момент прикрепления. Если имеется смесь различных диссоциированных конформаций, важными становятся относительные скорости связывания актина.

Материалы и методы

Биохимия. Регуляторная легкая цепь (RLC) кроличьего миозина S1 была заменена на RLC куриного желудка с меткой Penta-His, биотин-зависимой транскарбоксилазой (BDTC). Кодирующую последовательность слитого белка BDTC-RLC (11) клонировали в вектор экспрессии pET16b. Вектор экспрессии был введен в Escherichia coli , BL21 OMPT ^— ION ^— . Экспрессию белка проводили стандартными методами.Слитый белок BDTC-RLC получали растворением телец включения в 6 М гуанидин · HCl, 20 мМ Трис · HCl, 150 мМ NaCl и 10 мМ DTT, pH 7,5. Солюбилизированный гибридный белок хранили при -20 ° C. Замену легкой цепи проводили, как описано (12), с молярным отношением миозина S1 к BDTC-RLC 1: 2 при 30 ° C в течение 30 мин в 50 мМ Hepes (pH 7,5), 500 мМ NaCl, 10 мМ. ЭДТА и 10 мМ ДТТ. Для экспериментов с одной молекулой покровные стекла из нитроцеллюлозы покрывали 1 мг / мл BSA в 25 мМ Hepes, pH 7.4/25 мМ KCl / 4 мМ MgCl ₂ (буфер A) в течение 1 мин, промыт буфером A, инкубирован с 0,3–1 мкг / мл миозина S1 BDTC-RLC в течение 10 мин, а затем снова промыт буфером A перед добавление реакционной смеси (F-актин) -бусинок. Реакционная смесь включала стандартную систему дезоксигенирования (1% β-меркаптоэтанол, 0,2 мг / мл каталазы, 1 мг / мл глюкозооксидазы и 2 мг / мл глюкозы) и гексокиназу [0,01–0,1 мкг / мл для экспериментов с участием АДФ и аденил-5’илимидодифосфат (AMPPNP)]. Гантели из гранул актина были изготовлены с использованием биотинилированного актина и захваченных гранул нейтравидина, как описано (13).Несмотря на обширную промывку и блокирование, мы обнаружили, что было трудно одновременно использовать связь биотин-авидин для связывания миозина S1 с фиксированной гранулой. Однако, как подробно описано ниже, прикрепление S1 с биотинилированной легкой цепью к поверхности, предварительно покрытой BSA, привело к относительно специфическому прикреплению через легкую цепь. Константы связывания миозина для ADP, PP _i и AMPPNP все достаточно высоки, чтобы отделенный миозин был насыщен лигандом даже при самых низких используемых концентрациях.

Захват. Описаны устройство оптического пинцета, методы калибровки и т. Д. (14). Все эксперименты проводились при комнатной температуре. Ранее два квадрантных детектора (КТ), используемые для отслеживания положения захваченных шариков, освещались путем разделения всего изображения, что уменьшало интенсивность света в 2 раза. Поле уменьшалось вдвое с помощью зеркала под углом 45 °, чтобы проецировать изображение каждую бусинку на отдельную квантовую точку с полной интенсивностью. Разделение квантовых точек соответствовало разделению изображения захваченных шариков.Чувствительность квантовых точек была откалибрована с использованием шагового двигателя для поворота тонкого (0,5 мм) предметного стекла микроскопа на ± 7,5 °, чтобы получить известное латеральное смещение изображения шарика (). Положительная обратная связь обычно применялась к обеим лазерным ловушкам для расширения линейного диапазона кривой силы-расширения вдоль оси актина (14). Положение шариков регистрировали при 10 кГц в течение периодов 100 с или для условий с длительным взаимодействием при 5 кГц в течение периодов 400 с. Взаимодействия обнаруживались по уменьшению дисперсии смещения в течение связанных периодов с использованием метода скрытого Маркова (15).

Калибровка КТ по ​​смещению изображения шарика. ( Вставки ) Иллюстрация смещения оптического пути после поворота предметного стекла микроскопа (S) ± 7,5 °.

Измерение рабочего хода. Рабочий ход миозин-нуклеотидного комплекса можно оценить по разнице в средних положениях гантели в свободном и связанном периодах, при условии, что усреднение проводится по событию, а не по времени (16). Отличная от нуля разница в усредненных по времени перемещениях будет указывать на то, что при перемещении в ловушках была совершена чистая работа, что не согласуется с условиями равновесия.В принципе, усреднение событий обнаруживает любой рабочий ход, сделанный в условиях равновесия. Детальная балансировка требует, чтобы отслоение происходило медленнее при отрицательных деформациях; положительные смещения в связанных периодах уравновешиваются меньшим количеством отрицательных смещений большей продолжительности, так что усредненное по времени смещение при связывании равно нулю. Можно было только удовлетворительно проверить, выполнялись ли эти условия для миозиновых комплексов, для которых было достаточно большое количество взаимодействий (PP _i и AMPPNP), и для этих случаев условие было выполнено в пределах экспериментальной ошибки.

Метод усреднения событий для измерения рабочего хода также предполагает, что актиновая нить связывает миозин равномерно без каких-либо конкретных участков взаимодействия. Мы обнаружили, что это не так (14), и что индивидуальное смещение было суммой связующего хода, вызванного тепловыми флуктуациями, и рабочего хода, производимого циклом миозинового поперечного мостика. Таким образом, ход связывания зависит от относительного положения миозина по отношению к целевой зоне. Чтобы усреднить этот эффект до нуля, необходимо продвинуть актин мимо миозина на целое число актиновых повторов (15).показывает положения, в которых происходят взаимодействия в ходе записи, и можно видеть, что сначала одна целевая зона, а затем вторая попадает в поле зрения миозина, и что в каждой целевой зоне четко видны отдельные мономеры. Подобные полосы целевой зоны наблюдались для всех изученных миозиновых комплексов, и пример показан для PP _и (см.). Однако такие полоски мономера были менее заметны в случаях, когда частота взаимодействия была низкой.Все наши измерения рабочего хода были сделаны путем усреднения по одному или нескольким повторам актина. Рабочий ход измеряется относительно базовой линии, полученной из среднего положения свободной гантели. Движение ловушек во время связанного события невелико, и результирующее движение шариков незначительно из-за высокого отношения жесткости миозина к жесткости ловушки.

( a ) График зависимости времени от положения событий связывания миозина в присутствии 5 мкМ АТФ.В этом эксперименте гантель перемещалась на два актиновых повтора (≈74 нм) мимо фиксированного шарика, покрытого BDTC-RLC S1, в течение 100 с, что показано широкой светло-серой стрелкой, ширина которой соответствует тепловому шуму ( 2 × SD). ( b ) Диаграмма актина связывает положение мономеров со связанными событиями. Молекула миозина может получить доступ к каждому мономеру только в течение ограниченного периода во время общего движения гантели мимо миозина. В начале записи взаимодействие происходит с группой мономеров в одной целевой зоне (внизу слева), а во второй части — с группой в следующей целевой зоне (вверху справа).Рабочий ход от этого рекорда составил 5,6 нм.

Десять секунд следа 1 мМ PP _i при нормальных ионных условиях (25 мМ KCl), показывающего объединенные события ( a ), и 10 секунд при более высокой ионной силе (100 мМ KCl) с чистыми событиями ( b ). В большинстве случаев гантель может рассматриваться как жесткий объект в одной ловушке, жесткость которой возникает из-за того, что две ловушки действуют параллельно. Суммарная жесткость ловушек в этом эксперименте составляла 0,07 пН / нм: отношение дисперсии для лучшего шарика 12.( c ) График зависимости времени от положения событий связывания миозина аналогично. В этом случае наклон составляет 124 нм и видны три целевые зоны. Широкая светло-серая стрелка представляет движение гантели, ширина соответствует тепловому шуму (2 × SD). ( d ) Скорость диссоциации против [PP _i ]. ( e ) Все гистограммы взаимодействий основаны на линейных изменениях от одной гантели [PP _i ] при 0,5 мМ.

Кинетика взаимодействия актина, миозина и лиганда. Комплексы миозинового лиганда связываются с актином в два этапа с последующим высвобождением лиганда. A * представляет состояние высокой флуоресценции меченного пиреном актина, а A — состояние гашения после образования прочно связанного комплекса (17):

[1]

Для трех исследованных здесь лигандов была исследована кинетика (17 ), а шаги 1 и 3 можно рассматривать как быстрые равновесия относительно шага 2, который является наиболее вероятным кандидатом на связь с рабочим ходом.Минимальная концентрация лиганда, которую мы использовали, была намного больше, чем константа диссоциации миозина, и, таким образом, весь миозин, не связанный с актином, находится в состоянии M.L. Для каждого из лигандов мы использовали концентрации значительно ниже константы диссоциации от AM, и в этом случае общая отслеживаемая реакция была A * + ML → AM + L. В случае ADP мы также могли использовать концентрации, близкие к насыщению. AM.L, что позволило отдельно определять рабочий ход на связке A * + ML → AM.L и при диссоциации AM.L → AM + L. Для лигандов PP _i и AMPPNP самые высокие использованные концентрации, вероятно, привели к насыщению <25%, судя по максимальной скорости диссоциации, сообщенной в исследованиях растворов (17).

Присоединение S1 через биотинилированный RLC. Связывание модифицированного S1 с поверхностью тестировали с помощью простого анализа связывания актина, в котором поверхность нитроцеллюлозы сначала покрывали 2 мг / мл БСА в течение 1 мин. Концентрацию 1 мкг / мл S1 с биотинилированной легкой цепью или без нее инкубировали в течение еще 10 мин, и, наконец, в проточную кювету добавляли 2 мкг / мл флуоресцентных актиновых нитей на 10 мин перед промывкой и подсчетом связанных актиновых нитей.Примерно в 10 раз больше актиновых филаментов, связанных с поверхностью, инкубированной с BDTC-RLC S1, чем с нормальным S1 (см.), Указывает на то, что 90% модифицированного S1 связывается через его легкую цепь и, таким образом, вероятно, будет доступным для взаимодействия с актином. Мы обнаружили, что скорость движения в анализе подвижности актина при комнатной температуре, когда S1 был связан через его легкую цепь, составляла ≈4-5 мкм / с, в два-три раза больше, чем когда S1 был неспецифически связан с нитроцеллюлозой. Этот показатель очень похож на тот, который был обнаружен Iwane et al. (11), где биотинилированный S1 был связан с поверхностью стрептавидина. Протокол BSA использовался с поверхностью из стеклянных шариков для экспериментов с ловушкой. Обширные сравнения биотинилированного S1, присоединенного таким образом, с S1, связанным непосредственно с поверхностью нитроцеллюлозы, показали, что первый дал более последовательные результаты. Предварительные эксперименты предполагают, что это открытие, по крайней мере частично, связано с тем, что голова более свободно вращается и, таким образом, принимает правильную ориентацию по отношению к актиновому филаменту.

меченных родамином-фаллоидином актиновых филаментов, используемых для тестирования связывания S1 ( a ) и биотина RLC S1 ( b ) на поверхности, покрытой BSA. (Шкала: 20 мкм.)

Результаты

Миозин-пирофосфат (M.PP _i ). В растворе сообщаемая скорость связывания M.PP _i с актином составляет 10 ⁷ M ^{— 1} · с ^{— 1} (17), что на порядок быстрее, чем M.ADP. P _i (10 ⁶ M ^{— 1} · s ^{— 1} ).Наши первоначальные результаты сразу же предоставили доказательства этой разницы, потому что периоды низкой дисперсии генерировались с высокой частотой (). Более того, запись не была распознана как следствие единичных взаимодействий. Мы интерпретировали это поведение как результат быстрого повторного связывания с одной миозиновой головкой, а не как результат взаимодействия с более чем одной головкой. При низкой плотности миозина, как правило, необходимо было тщательно обыскать четыре или пять фиксированных миозин-несущих шариков, прежде чем наблюдались взаимодействия.Более того, чистые одиночные взаимодействия наблюдались при одинаковых плотностях миозина с АТФ. Чтобы преодолеть эту проблему, мы увеличили концентрацию KCl в буфере с 25 до 100 мМ, поскольку известно, что скорость связывания актина со всеми состояниями миозина сильно убывает от ионной силы. При такой более высокой ионной силе мы наблюдали четко определенные взаимодействия, хорошо разделенные во времени (). В этих исследованиях наблюдаемое соотношение дисперсии, то есть отношение дисперсии положения гранул, когда актиновый филамент был свободен и связан с миозином, обычно составлял ≈15.Взаимодействия были относительно продолжительными и поэтому легко обнаруживались. показывает, что взаимодействия могут быть связаны со специфическими мономерами актина, которые попадают в зоны-мишени. Наблюдаемая скорость диссоциации AM, вызванной PP _i , линейно возрастала в нашем экспериментальном диапазоне [PP _i ] () без признаков плато, константа скорости второго порядка составляла 63 мМ ^{— 1} · С ^{— 1} . Для acto-S1 в растворе ( I = ≈0,015 и 20 ° C) максимальная скорость диссоциации составляет 250 с ^{— 1} , а полумаксимальная скорость происходит при 0.5 мМ PP _i (17). Увеличение ионной силы снижает сродство большинства лигандов и частично объясняет отсутствие кривизны до 1 мМ и соответствующее 8-кратное уменьшение константы скорости второго порядка.

показывает гистограмму, полученную в результате экспериментов, в которых гантель перемещалась мимо фиксированного миозинового шарика на два актиновых повтора, чтобы получить истинный рабочий ход. Среднее смещение (рабочий ход) одной гантели (для постоянной полярности актина), которая испытала 2904 взаимодействия, наблюдаемых в 13 наборах данных за 100 с, от трех молекул S1, было 0.4 ± 1 нм (среднее ± SEM) (). Для описанных здесь экспериментов знак смещения не имеет значения, поскольку полярность актинового филамента не была определена, и, следовательно, наборы данных с разных гантелей нельзя было объединить. Скорость диссоциации при 0,5 мМ PP _i , ≈30 с ^{— 1} была намного меньше максимального значения, наблюдаемого в растворе (250 с ^{— 1} ), так что связанный миозин в основном находится в форма AM, а не AM.ПП _и . Однако самые низкие использованные концентрации PP _i все еще были достаточными для насыщения свободного миозина, и в этом эксперименте отслеживался рабочий ход реакции A + M.PP _i → AM + PP _i .

Таблица 1.

Рабочие штрихи для различных миозиннуклеотидных комплексов

Myosin-AMPPNP (M. Чтобы наблюдать чистые одиночные взаимодействия, как в, снова необходимо было использовать 100 мМ KCl. Гексокиназу использовали, чтобы избежать воздействия загрязняющего АТФ. Скорость диссоциации AM отложена против [AMPPNP] в; эта скорость также линейно зависела от концентрации, что согласуется со слабым связыванием AMPPNP с acto-S1.Константа скорости второго порядка диссоциации составила 5,2 мМ ^{— 1} · с ^{— 1} , для сравнения со значением acto-S1, равным 11 мМ ^{— 1} · с ^{— 1} (18). Наша максимальная наблюдаемая скорость ≈10 с ^{— 1} была намного меньше, чем скорость в растворе при насыщении [AMPPNP] [> 100 с ^{— 1} : (17)], что указывает на то, что в наших экспериментах [ AMPPNP] далека от насыщения, и что наблюдаемая нами последовательность связывания по существу представляет собой A * + M.AMPPNP → A.M + AMPPNP. Для измерения рабочего хода использовались наклонные ловушки, и показана гистограмма смещений, основанная на данных при 1 мМ AMPPNP от одной гантели, взаимодействующей с пятью молекулами S1, собранными во время 13 наклонов. Рабочий ход составил 0,1 ± 0,2 нм (среднее значение ± SEM, n = 3023) ().

( a ) Десять секунд следа 1 мМ AMP-PNP с использованием буфера, содержащего 100 мМ KCl и 1 мг / мл гексокиназы. Комбинированная жесткость ловушек составляла 0,065 пН / нм: отношение дисперсии для лучшего шарика 22.( b ) Скорость диссоциации как функция [AMPPNP]. ( c ) Все гистограммы взаимодействий основаны на наклонах одной гантели. [AMPPNP] при 1 мМ.

Миозин-АДФ (M.ADP). Известно, что АДФ диссоциирует АМ намного медленнее, чем АТФ, PP _i или AMPPNP, и наблюдаемые нами длительные взаимодействия качественно согласуются с этим фактом (). В этом случае для чистых взаимодействий требовалась еще более высокая ионная сила (500 мМ KCl). Гексокиназа была необходима, чтобы избежать воздействия загрязняющего АТФ.В отличие от предыдущих случаев, скорость АДФ-индуцированной диссоциации от актина как функция [АДФ] () достаточно близка к насыщению, чтобы оценить максимальную скорость ≈ 3 с ^{— 1} и кажущуюся константу связывания чуть более 1 мМ. Значение раствора для максимальной скорости диссоциации хорошо согласуется [2–3 с ^{— 1} (17)], хотя значение раствора для связывания АДФ с acto-S1 в 5–10 раз меньше. Наша способность приближаться к насыщающим концентрациям АДФ ожидается от более жесткой константы связывания АДФ acto-S1 по сравнению с AMPPNP или PP _i .Из-за длительного времени жизни актиновые филаменты перемещались мимо миозина с более низкой скоростью (≈0,2 нм / с). Рабочий ход было легче измерить при высоком [ADP] из-за более короткого времени взаимодействия, и при 1 мМ ADP мы получили значение 1,2 ± 0,4 нм (среднее ± SEM, n = 1213). При 50 мкМ ADP () наше значение существенно не отличалось от нуля (0,6 ± 0,5 нм, среднее ± SEM, n = 800) (). При насыщении [АДФ] наблюдается, прежде всего, A * + M.ADP → AM.АДФ, тогда как при самых низких используемых концентрациях первичной реакцией является A * + M.ADP → A.M + ADP. Ни одна из реакций не связана с рабочим ходом. Следует отметить, что в ходе наших экспериментов с M.ADP мы обнаружили, что две из 58 исследованных молекул S1 демонстрируют согласованное поведение, характеризующееся скоростью диссоциации в ≈10 раз быстрее, чем в среднем. Неясно, ответственна ли изоформа или деградированная форма миозина, но скорость не соответствует значениям раствора для быстрого миозина кролика, и такие данные были отброшены.

( a ) Двадцать второй след 0,5 мМ АДФ с использованием буфера, содержащего 0,5 М KCl и 10 нг / мл гексокиназы. Комбинированная жесткость ловушек составляла 0,03 пН / нм: отношение дисперсии для лучшего шарика 21. ( b ) Скорость диссоциации как функция [ADP]. ( c ) Гистограмма набора данных линейного изменения при 50 мкМ ADP (одна гантель, 12 × 400-секундные записи S1, 800 взаимодействий).

Миозин. Миозин — это состояние, которое наиболее прочно связывается с актином, и снова была необходима высокая ионная сила, чтобы поднять скорость диссоциации до приемлемого уровня.Экспериментальная запись показана в. При 0,5 М KCl мы наблюдали скорость диссоциации AM порядка 0,2 с ^{— 1} , для сравнения со значением раствора 0,27 с ^{— 1} при 0,15 М KCl (17). Из-за долгого времени существования взаимодействий эксперименты с линейным нарастанием оказались довольно сложными, но при использовании медленных линейных изменений (≈0,1 нм · с ^{— 1} : один повтор актина за 400 с) было получено пять наборов данных для одной гантели, что дало рабочий ход 0.1 ± 0,9 нм (среднее ± SEM, n = 223) (гистограмма и). Хотя эта оценка основана на небольшом наборе данных, две другие гантели дали достаточно событий, чтобы дать оценки, оба из которых были близки к нулю. Значительное количество дополнительных данных также соответствовало рабочему ходу, близкому к нулю.

( a ) Двадцать секунд взаимодействия миозин-актин (0,5 M KCl и 1 мкг / мл апиразы). Комбинированная жесткость ловушек составляла 0,041 пН / нм: отношение дисперсии для лучшего шарика 18. ( b ) Гистограмма и события одной записи с интервалом 1 нм, объединенная гистограмма пяти записей продолжительностью 400 с с линейным нарастанием одноактинового повтора с интервалом 5 нм (одна гантель, 5 × 400-с записей одного S1, 223 взаимодействия).

Обсуждение

При рассмотрении наших результатов удобно принять ориентацию плеча рычага в состоянии строгости AM за точку отсчета. Мы не наблюдаем рабочего удара при связывании миозина и, таким образом, делаем вывод, что апоформа миозина связывается в положении окоченения. Нулевые штрихи, наблюдаемые для M.ADP, M.PP _i и M.AMPPNP при концентрациях лиганда значительно ниже насыщения, где конечным продуктом является AM, подразумевают, что рычажные рычаги форм M.ADP, M.PP _i и М.AMPPNP, которые связываются с актином, также находятся в положении окоченения во время связывания. При насыщении АДФ наблюдается реакция A * + M.ADP → AM.ADP: мы по-прежнему не наблюдаем рабочего хода, и, поскольку M.ADP был отнесен к состоянию окоченения, то же самое и AM.ADP. Это наблюдение согласуется со структурными исследованиями миозина II (19), хотя следует признать, что исследования волокон показали, что небольшое движение рычага все еще может контролировать скорость высвобождения АДФ (20). Актин связывается с M.ADP и образует слабосвязанный комплекс, который Дживс (21) назвал A-MD (состояние A). Тейлор (17) также охарактеризовал это состояние и заметил, что константа равновесия между ним и AM.ADP аналогична константе состояния AM’.ADP, с которым связывается P _i (22). Эквивалентность этих двух состояний не доказана, но для упрощения обсуждения мы будем называть исходное состояние, сформированное при связывании M.ADP, AM’.ADP. Мы не наблюдаем инсульта ни при высоких, ни при низких концентрациях АДФ, и наиболее вероятная интерпретация состоит в том, что рабочий ход происходит на одном из этапов между AM.ADP.P _i и AM′.ADP (23) и что последний является состоянием постобработки хода.

Единственным известным промежуточным продуктом, который дает рабочий ход, является M.ADP.P _i , а конечным результатом привязки является состояние окоченения AM. Конечным продуктом связывания состояний миозина, M.ADP, M.PP _i и M.AMPPNP с актином также является AM, но не приводит к рабочему инсульту. Естественная интерпретация состоит в том, что M.ADP.P _i связывается в форме, отличной от других состояний миозина, что согласуется с исходной схемой Lymn-Taylor (3).

Наши наблюдения согласуются с текущими интерпретациями кристаллических структур (для обзора см. Ссылку 9), в которых рабочий ход совпадает с переходом между кристаллическими структурами с закрытыми и открытыми карманами связывания нуклеотидов. В отсутствие актина флуоресценция миозиновых остатков триптофана, нативных (24) или сконструированных (25), коррелирует с пропорциями открытых и закрытых состояний миозин-нуклеотидных комплексов. Myosin и M.ADP открыты, а M.PP _i открыт на ≈90%, тогда как M.AMPPNP (26) открыт только на ≈50%, а M.ADP.P _i почти полностью закрыт (по крайней мере, при 20 ° C). Подтверждение ассоциации перехода от открытого состояния к закрытому с механической конформацией миозиновой головки получено из исследований спирального порядка миозиновых филаментов в мышечных волокнах, расслабленных в различных условиях (27). Было обнаружено, что изменения температуры, которые изменяют соотношение открытого и закрытого состояний, определенное из измерений флуоресценции, влияют на спиральный порядок предсказуемым образом.

Наши данные можно интерпретировать с точки зрения связывания миозина с актином в открытой форме, что приводит к состоянию окоченения без рабочего удара. M.ADP и M.PP _и находятся в той же конформации, что и миозин, и ведут себя аналогичным образом (). Состояние M.ADP.P _i находится в закрытой форме, как таковое связывается с актином и дает рабочий ход при формировании открытого состояния AM. Для M.AMPPNP открытое и закрытое состояния заселены одинаково, и наше наблюдение рабочего хода, близкого к нулю, подразумевает относительные скорости связывания открытого и закрытого состояний с актином и высвобождения лиганда.Сообщалось, что миозин, M.ADP и M.PP _и , которые в основном находятся в открытой форме, связываются по крайней мере на порядок быстрее (10 ⁸ , 10 ⁷ и 10 ⁷ M ^{— 1} · s ^{— 1} ), чем M.ADP.P _i , состояние закрытой формы (10 ⁶ M ^{— 1} · s ^{— 1} ). Как это бывает, AMPPNP, форма 50/50, связывается вдвое быстрее, чем PP _i (5 × 10 ⁶ M ^{— 1} · s ^{— 1} ).Лиганды связываются с открытой формой и, следовательно, должны также диссоциировать от этой формы. Отсутствие рабочего хода можно легко объяснить, если, как представляется, открытая форма M.AMPPNP связывается намного быстрее, чем закрытая форма.

Модель миозина и миозин-нуклеотидных комплексов, где плечо миозинового рычага может существовать в любой из двух дискретных ориентаций (открытое и закрытое), когда оно свободно или связано с актином. Миозин в закрытом состоянии связывается с актином перед переходом в открытое состояние с соответствующим колебанием плеча рычага.

Наше наблюдение о том, что измеримый рабочий ход не связан со связыванием безнуклеотидного миозина или M.ADP, находится в противоречии с прямой корреляцией между образованием связи окоченения и рабочим ходом. Это подразумевается в простой интерпретации модели 3G, в которой все миозин-нуклеотидные комплексы при связывании с актином проходят через конформационное изменение от слабого к сильному или от A-to-R (8). Мы показываем здесь, что такие переходы не обязательно связаны с рабочим ходом.Если важность перехода от открытого к закрытому подтверждена, открытая или закрытая метка может оказаться более значимой, чем слабая или сильная, или метки A или R.

Работа Куна (28) по эффекту связывания AMPPNP с волокнами предполагает, что он по крайней мере частично меняет рабочий ход. Этот результат не сразу согласуется с нашими наблюдениями, но решетка филаментов и двуглавая природа миозина могут вносить свой вклад в этот эффект (29).

Мы хотели бы измерить рабочий ход закрытых форм миозина, отличных от M.ADP.P _i , особенно M.ADP.vanadate или. Однако кинетика взаимодействия лигандов неблагоприятна. Скорость ванадата или связывания с AM.ADP (1 мин ^{— 1} при низкой ионной силе) настолько мала, что было бы трудно построить статистически значимое описание взаимодействия и ускорения скорости диссоциация AM.ADP ванадатом достаточно мала, поэтому было бы трудно разделить актин-связывающие события M.ADP и M.ADP.vanadate.

Таким образом, мы обнаружили, что единственным состоянием, дающим рабочий ход, был M.ADP.P _i , и мы пришли к выводу, что это связывается в форме предрабочего хода, отличной от других состояний, и, таким образом, должно быть как минимум две механические конформации миозина при диссоциации от актина. Мы показываем, что наши наблюдения согласуются с двумя состояниями, соответствующими состояниям кристалла, которые называются открытыми и закрытыми карманами связывания нуклеотидов.

Благодарности

Мы благодарим Dr.Азуко Иване за щедрое предоставление нам RLC-конструкции BDTC для куриных желудков. Эта работа была поддержана Советом медицинских исследований Соединенного Королевства и Wellcome Trust.

Примечания

Сокращения: AM, актомиозин; S1, подфрагмент 1; M.ADP, миозин-ADP; M.PP _i , миозинпирофосфат; AMPPNP, аденил-5’илимидодифосфат; M.AMPPNP, миозин-AMPPNP; RLC, регуляторная легкая цепь; BDTC, биотин-зависимая транскарбоксилаза; КТ, квадрантный детектор.

Список литературы

вернуться к работе после инсульта среди лиц трудоспособного возраста; Шестилетнее наблюдение

Абстрактные

Цели

Инсульт — одно из самых распространенных и ресурсоемких заболеваний общества.Инсульт среди населения трудоспособного возраста увеличивается в разных частях мира. Неполное возвращение к работе (RTW) после больничного после инсульта влечет за собой негативные последствия для пострадавшего и экономическое бремя для общества. Целью этого исследования было изучить частоту RTW и факторы, связанные с RTW, в шестилетнем периоде наблюдения после инсульта.

Методы

Были проанализированы данные 174 человек в возрасте 63 лет и младше, впервые перенесших инсульт в 2009–2010 годах в Гётеборге.Исходные характеристики были собраны из медицинских записей, а Шведское управление медицинского страхования предоставило информацию о больничных листах до 6 лет после инсульта. Было представлено время до события, и регрессия Кокса, а также логистическая регрессия были использованы для анализа факторов риска для отсутствия RTW.

Результаты

Уровень RTW составил 74,7% в конце периода наблюдения. Участники продолжали принимать RTW до тех пор, пока не прошло чуть более 3 лет после инсульта. Зависимость при выписке (по модифицированной шкале Рэнкина) и отпуск по болезни до инсульта были значимыми факторами риска отсутствия RTW через 1 год с отношением шансов 4.595 и 3,585 соответственно. Те же факторы были значимыми в отношении времени до события в течение шести лет после инсульта с соотношением рисков 2,651 и 1,929 соответственно.

Выводы

RTW после удара является неполным, однако RTW возможен в течение более длительного периода времени, чем предполагалось ранее. Было показано, что более тяжелая инвалидность при выписке из больницы и отпуск по болезни до инсульта являются факторами риска для отсутствия RTW. Эти знания могут способствовать более индивидуальной профессиональной реабилитации.

Образец цитирования: Вестерлинд Э., Перссон Х.С., Суннерхаген К.С. (2017) Возвращение к работе после инсульта у лиц трудоспособного возраста; Шестилетнее наблюдение. PLoS ONE 12 (1): e0169759. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0169759

Редактор: Ева Видерстрём-Нога, Медицинский факультет Университета Майами, США

Поступила: 22 июля 2016 г .; Одобрена: 21 декабря 2016 г .; Опубликован: 6 января 2017 г.

Авторские права: © 2017 Westerlind et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: В связи с этическими ограничениями данные доступны по запросу. Заинтересованные исследователи могут направлять запросы на получение данных авторам (свяжитесь с профессором Катариной С. Суннерхаген, электронная почта: [email protected]). Согласно шведскому законодательству http: // www.epn.se/en/start/regulations/, разрешение на использование данных предоставляется только для того, на что была подана заявка и затем одобрена Советом по этике. Несоблюдение правил рассматривается как нарушение научной дисциплины.

Финансирование: Это исследование частично финансировалось Шведским фондом сердца и легких и Шведским фондом мозга.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Инсульт — одно из наиболее распространенных и ресурсоемких заболеваний, в 2010 г. во всем мире зарегистрировано около 17 миллионов случаев [1].Во всем мире примерно 31% людей на момент инсульта моложе 65 лет, в Швеции этот процент составляет 20% [2]. Общая заболеваемость первым инсультом в Швеции снизилась, однако количество инсультов в этой молодой возрастной группе увеличилось [3].

Работа — это широкое понятие, которое может быть определено исключительно как оплачиваемая работа (по найму или самозанятости) или включает другие занятия, такие как волонтерская работа и работа по дому. Неработающие также можно разделить на многочисленные подгруппы: студенты, пенсионеры, безработные и ищущие работу или безработные, но не готовые к работе [4].Было высказано предположение, что работа полезна для здоровья [5, 6], а отсутствие работы может быть фактором риска инсульта [7, 8]. Кроме того, работа после инсульта является значимым фактором удовлетворенности жизнью в целом у молодых людей, особенно мужчин, у которых в 2,5 раза выше риск недовольства, если они не вернутся на работу (RTW) [9]. Отсутствие работы может повлечь за собой изоляцию и снижение качества жизни пострадавшего, но также является проблемой для правительств и работодателей, не в последнюю очередь с экономической точки зрения [10].В 2014 г. косвенные факторы (отсутствие по болезни, досрочный выход на пенсию и производственные годы, потерянные из-за смерти от инсульта) составили 21% от общей стоимости инсульта в Швеции [11]. Отсутствие на работе по болезни — важная проблема общественного здравоохранения, требующая дальнейшего изучения [12].

Сообщаемая частота RTW после инсульта широко варьируется в разных исследованиях. Австралийское исследование [13] показало, что уровень RTW составляет 75% в течение первого года после инсульта, в то время как 48% вернулись к тому же уровню работы, что и до инсульта, в течение 6 лет после участия в повседневной деятельности, проведенного в Швеции. [14].Кроме того, в течение одного года последующего исследования 45% вернулись к оплачиваемой работе (30% в той же степени, что и до инсульта, и на 15% меньше, чем до этого) [15]. Все вышеупомянутые исследования использовали самооценку RTW в качестве результата. Датское исследование, опубликованное в 2016 году, показало, что 50% из них навсегда уволились или все еще находятся в отпуске по болезни через год после инсульта [16]. Самооценка здоровья была тесно связана с RTW, и те, у кого был легкий или умеренный инсульт, были значительно более склонны к RTW, чем те, у кого был тяжелый инсульт [16].

Целью этого исследования было изучить частоту RTW и факторы, связанные с RTW, в шестилетнем периоде наблюдения после инсульта.

Материалы и методы

Предметы и настройки

Все пациенты в возрасте 18–63 лет с первым в истории клиническим инсультом с кодами Международной классификации болезней I61 внутримозговое кровоизлияние (ICH) или I63 ишемический инсульт (IS) в больнице Sahlgrenska University, Sahlgrenska, Gothenburg, Швеция, с 4 февраля ^{-го года. Идентифицировано} 2009 г. — 2 декабря ^-е 2010 г.Кроме того, пациенты должны были проживать в пределах 35 км от больницы и лечиться в инсультном отделении, нейрохирургическом отделении или отделении интенсивной терапии. Сальгренска — крупнейшая из трех основных больниц Гётеборга. Включенные пациенты являются участниками расширенного продольного исследования инсульта на руке в Университете Гетеборга (SALGOT) [17, 18].

Исходные характеристики, тип инсульта, пол, возраст, реперфузионное лечение (тромболизис и тромбэктомия) и сопутствующие заболевания были собраны с помощью медицинских карт.Шкала инсульта Национального института здоровья (NIHSS, 0–42 балла, чем ниже балл, тем лучше [19]) и шкала комы Глазго (GCS, 3–15, более высокий балл — лучше [20]) использовались для измерения степени тяжести инсульта. инсульт на момент поступления в больницу. GCS оценивали только у тех пациентов, у которых не измеряли NIHSS; то есть пациент с сильно сниженным сознанием. Инвалидность пациента при выписке из больницы оценивалась по модифицированной шкале Рэнкина (mRS, 0–6, чем ниже балл, тем лучше [21]).

Качество жизни, связанное со здоровьем, измерялось с помощью измерений EuroQol-5 (EQ-5D), включая мобильность, уход за собой, обычную активность, боль / дискомфорт и тревогу / депрессию, а также дополнительную визуально-аналоговую шкалу (ВАШ) [22]. EQ-5D был разослан всем пациентам в качестве повторного почтового опроса примерно через пять лет после инсульта (среднее время 59 месяцев). Показатели смертности и причины смерти в течение периода исследования были собраны из регистра смертности в Национальном совете здравоохранения и социального обеспечения Швеции.Шведское управление медицинского страхования предоставило информацию о досрочном выходе на пенсию (компенсация по болезни) и отпуске по болезни (пособие по болезни) за год до инсульта, а также о количестве дней досрочного выхода на пенсию или отпуска по болезни до шести лет после инсульта. По административным причинам последующее анкетирование и сбор данных из Больничной кассы не проводились одновременно.

Рабочее состояние

В течение первых двух недель отпуска по болезни в Швеции работодатель выплачивает пособие по болезни.После этого пособие по болезни выплачивает Шведское бюро медицинского страхования, которое является государственным органом. В процессе RTW Управление медицинского страхования использует пошаговую модель реабилитации для оценки работоспособности человека с более строгими критериями, применимыми к более длительному отсутствию на работе. Работодатели имеют право на субсидию на заработную плату, если они нанимают людей с ограниченными возможностями [10]. Досрочный выход на пенсию — это потенциальная договоренность вместо отпуска по болезни для человека, у которого RTW вряд ли из-за болезни, однако RTW все еще возможен даже после досрочного выхода на пенсию.Участники, которые раньше были на пенсии до инсульта, не были включены в основной анализ настоящего исследования. Вступление участников в исследование началось при поступлении в больницу с симптомами инсульта. Период исследования определялся как количество дней, в течение которых было зарегистрировано пособие по болезни или компенсацию по болезни после инсульта. Основным показателем результата был RTW. RTW был определен как более не зарегистрированный для получения компенсации по болезни или пособия по болезни (ни полный, ни неполный рабочий день) в Шведской больничной кассе и не покидавший его в течение года после достижения 65-летнего возраста (выход на пенсию по старости в Швеции) или в течение месяц от смерти.

Ковариаты

Возможными предикторами RTW были инвалидность при выписке из больницы (оценка mRS) и отпуск по болезни до инсульта. Оценка mRS была разделена на функциональную независимость, если баллы были между 0–2, а баллы 3–6 представляли зависимость [23]. В отпуск по болезни до инсульта входили те, кто получал пособие по болезни не менее двух недель в последний год перед инсультом. Возраст, пол и тип инсульта рассматривались как факторы, влияющие на значение, и были скорректированы в моделях множественной регрессии.

Коморбидность была представлена ​​как отсутствие, легкая, умеренная или тяжелая коморбидность в соответствии с индексом коморбидности Чарлсона [24], а также наличие сопутствующей патологии, потенциально влияющей на RTW. Последнее засчитывалось как «да», если участник имел одно из следующих заболеваний: инфаркт миокарда, диабет, злоупотребление алкоголем / наркотиками, психическое заболевание, рак, хроническая обструктивная болезнь легких, ревматическое заболевание или другие специфические заболевания.

NIHSS был представлен с общим баллом, а пункты, которые представляли когнитивные функции (Cog4, 0–9 баллов [25]) и двигательные функции (NIHSSmotor 0–16 баллов), также обрабатывались как отдельные переменные.GCS были представлены по характеристикам как легкая (13–15), умеренная (9–12) или тяжелая (3–8) при отсутствии данных NIHSS [26].

Ответы на анкету EQ-5D были пересчитаны в единое значение индекса, который, как и ВАШ, представляет качество жизни, связанное со здоровьем. Индекс рассчитывался для каждого участника по шведскому тарифу [27].

Статистические методы

Данные были обработаны и проанализированы в IBM SPSS 22. Уровень значимости был установлен как p-значение <0.05. Точный критерий Фишера и U-критерий Манна-Уитни использовались для исследования демографических различий между группами.

Непараметрические сравнения времени до RTW, до шести лет после инсульта, между двумя типами инсульта были выполнены с помощью кривой Каплана-Мейера и логарифмического рангового критерия [28]. Одной из причин цензуры была смерть в период исследования. Эта цензура нарушает предположение о неинформативности цензуры. Чтобы справиться с некоторыми последствиями нарушения, к смерти до RTW был применен подход наихудшего сценария.Это означает, что участники, умершие до RTW, были настроены на цензуру в конце периода исследования вместо классической даты смерти. Это сделано для того, чтобы получить более консервативную оценку RTW. Другой причиной цензуры является выход на пенсию по старости, и он устанавливается во время выхода на пенсию, поскольку это не нарушает предположение о неинформативности цензуры.

Полупараметрический анализ [28] времени до RTW был проведен с использованием модели пропорционального риска множественного кокса, основанной на данных за весь период исследования, а оценки предикторов были представлены как связь с отсутствием RTW.Переменные в модель были включены на основании клинической и теоретической значимости.

Факторы риска отсутствия RTW в течение одного года после инсульта были исследованы с использованием логистической регрессии [28], включая те же предикторы и вмешивающиеся факторы, что и в предварительно определенной модели Кокса. Результат логистической модели был установлен как отсутствие RTW в течение одного года после инсульта. Стратифицированные по возрасту модели логистической регрессии для вероятности отсутствия RTW через год после инсульта также были выполнены с целью исследования возможных различий в факторах риска между возрастными группами.Страты были построены с использованием возраста 50 лет на момент начала инсульта в качестве отсечки, создавая более молодую и старшую группы.

Для проверки соответствия моделей логистической регрессии были выполнены тесты Хосмера и Лемешоу и кривые рабочих характеристик приемника (ROC-кривые). Для модели Кокса кривые Каплана-Мейера и логарифм (-log (кривые выживаемости)) использовались для проверки серьезных нарушений с учетом предположения о пропорциональном риске. Графическое представление частичных остатков по сравнению со временем выживания использовалось для проверки зависящих от времени ковариат.При подозрении на временную зависимость использовалась дополнительная модель регрессии Кокса с зависящей от времени переменной для оценки потенциально значимой временной зависимости.

Этические соображения

Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и было одобрено Региональным этическим комитетом в Гетеборге (EPN) 5 мая ^-го 2008 (Dnr: 225–08) с дополнительной заявкой T801-10. Анкеты для последующего наблюдения были утверждены 5 июня ^-го 2013 (Dnr: 400–13), а поправка для Больничной кассы была утверждена 22 октября ^-го 2015 (Dnr T830-15).Письменное информированное согласие было предоставлено субъектами для участия в последующей части этого исследования. В Швеции данные, которые обрабатываются в рамках национальных регистров качества, являются исключением из общего правила согласия пациентов, поскольку они обеспечивают повышение качества ухода и лечения, что представляет общий интерес. Решение об этом было принято Шведской комиссией по проверке данных. Кроме того, в соответствии с шведским законом о персональных данных (personuppgiftslagen, шведский закон No.SFS 1998: 204) для сбора данных из медицинских карт для клинических целей и контроля качества не требуется информированного согласия.

Результаты

Характеристики

Общее количество пациентов в возрасте 18–63 лет на момент начала инсульта составило 211, большинство из которых составляли мужчины, а распространенность ишемического инсульта составила 78%, см. Таблицу 1. Средний возраст на момент инсульта составлял 53 года.

Из 211 человек 26 (12,3%) находились в отпуске по болезни и 37 (17,5%) досрочно вышли на пенсию до инсульта (рис. 1).Самой распространенной группой заболеваний среди людей, вышедших на пенсию, были психические заболевания, за которыми следовали боли и сердечно-сосудистые заболевания. Женщины преобладали в группе досрочного выхода на пенсию (p 0,033), а также были старше работающих участников (p 0,011). Не было достоверных различий по типу инсульта, NIHSS или mRS. При сравнении групп, находящихся в отпуске по болезни или нет до инсульта, не было выявлено значительных различий в отношении пола, возраста, типа инсульта, NIHSS или mRS.

Девятнадцать человек умерли (7 в течение первой недели после начала инсульта) вплоть до отправленного по почте опроса через пять лет после инсульта.Из 19 человек 7 были досрочно вышли на пенсию до инсульта, 10 умерли до RTW и 2 после RTW.

RTW

После исключения 37 человек, ранее вышедших на пенсию до инсульта, осталось 174 человека (рис. 1). Из них 130 (74,7%) выполнили RTW, 10 (5,7%) вышли на пенсию по старости, 10 (5,7%) скончались до RTW и 24 (13,8%) все еще получали компенсацию по болезни через шесть лет после инсульта. Ни один участник не оставался на пособии по болезни до конца периода наблюдения, и ни один участник, получивший компенсацию по болезни, не выполнил RTW.

Время до RTW, разделенное на тип инсульта, показано на рис. 2. Участники с IS возвращались с несколько большей скоростью, чем с ICH, однако разница не была значимой. RTW первого квартиля в течение 2,7 месяцев после инсульта (S.E. 0,7) и RTW второго квартиля в течение 12,7 месяцев (S.E. 2.2). Кривая для RTW вышла на плато чуть более 3 лет. После первого года после инсульта у 84 человек (48,3%) была RTW.

Факторы, связанные с RTW

Тридцать три (19.0%) из 174 человек имели сопутствующую патологию, которая потенциально могла повлиять на RTW, однако, как видно из таблицы 2, не было существенной разницы в RTW между людьми с сопутствующей патологией и лицами без нее (p 0,506). Оценка когнитивной функции (Cog4) и двигательной функции (NIHSSmotor) по NIHSS была оценена у 166 участников (95%). Были значительные различия между группами RTW и без RTW через шесть лет как в когнитивных способностях (p <0,0005), так и в моторной функции (p <0,0005) с меньшими нарушениями в группе RTW.

В логистической регрессии через один год после инсульта, показанной в таблице 3, mRS и больничный были включены в многомерную модель и скорректированы с учетом возраста, пола и типа инсульта. Зависимость от mRS и пребывание в отпуске по болезни до инсульта были значимо связаны с отсутствием RTW с OR 4,595 и 3,585 соответственно.

В регрессии Кокса через шесть лет после инсульта (таблица 4) mRS и больничный были включены в многомерную модель и скорректированы с учетом возраста, пола и типа инсульта.Зависимость от mRS и пребывание в отпуске по болезни до инсульта были значимо связаны с отсутствием RTW с HR 2,651 и 1,929, соответственно.

Анализ с разбивкой по возрасту

Не было существенной разницы в частоте RTW в течение первого года после инсульта между младшей (≤ 50 лет) и старшей группой (≥ 51 года). Как видно из таблицы 5, зависимость от mRS оказалась достоверно связанной с отсутствием RTW с OR 6,690 в старшей группе. В младшей группе значимости не обнаружено.Отпуска по болезни до инсульта не соответствовали критериям логистической регрессии и, следовательно, не были включены в анализ.

Качество жизни, связанное со здоровьем

Семьдесят шесть (46,9%) из 162 выживших участников ответили EQ-5D. Не было значительной разницы между респондентами и не отвечающими в отношении возраста (p 0,380), пола (p 0,494), типа инсульта (p 0,850), NIHSS (p 0,537), mRS (p 0,875) или отпуска по болезни до инсульта ( p 1.000).

Не было существенной разницы в значении индекса, рассчитанного с помощью EQ-5D, представляющего качество жизни, связанное со здоровьем, между группами RTW и без RTW (p 0.061) через шесть лет. Напротив, разница между группами по ВАШ была значительной (p 0,012) с более высокой самооценкой связанного со здоровьем качества жизни в группе RTW.

Обсуждение

В этом шестилетнем наблюдении после инсульта 74,7% участников сделали RTW. Более тяжелая инвалидность при выписке была значимым фактором для не-RTW через один и шесть лет. Находиться в отпуске по болезни до инсульта также было значительным фактором риска отказа от лечения в течение одного и шести лет после инсульта.

В текущем исследовании участники продолжали RTW даже до трех лет после инсульта, что ранее не показывалось с более коротким периодом наблюдения [13, 16]. Вывод важен не только для пациентов, но и для правительств при разработке политики в отношении этой важной проблемы здравоохранения и экономики. Знания о поздней RTW могут улучшить наше понимание времени и терпения, которые необходимы этим пациентам для профессиональной реабилитации, и избежать необоснованного давления на пациентов, чтобы RTW как можно быстрее.В группе, не принимавшей RTW, наиболее частым исходом был досрочный выход на пенсию. Несмотря на то, что система раннего выхода на пенсию вместо отпуска по болезни после длительного отсутствия на работе может снизить уровень RTW в Швеции, система предоставления субсидий к заработной плате работодателям за прием на работу лиц с ограниченными возможностями, возможно, может способствовать более высокому уровню RTW. . В текущем исследовании показатель RTW за один год составил 48,3% по сравнению с 75% в австралийском исследовании [13], 50% в датском исследовании [16], 62,4% в японском исследовании [29] и 35% в исследовании. исследование, проведенное в Великобритании [30].Три разных обзора с разным сроком наблюдения, в основном менее шести лет, дополнительно представляют значительно более низкую частоту RTW, чем в текущем исследовании [31–33]. Из-за различных систем отпусков по болезни, социально-политического контекста и культурных различий продолжительность отпуска по болезни после болезни может варьироваться в зависимости от страны [34]. Текущее исследование проводилось в университетской больнице с доступными специализированными методами лечения. Кроме того, Швеция является страной с высоким уровнем дохода, где медицинское обслуживание и реабилитация финансируются за счет налогов, и это может потенциально повлиять на возможность обобщения результатов на другие системы здравоохранения [35].Кроме того, дизайн исследования с шестилетним наблюдением и использование национальных записей вместо самооценки измерений для оценки RTW снизил риск выбывания и систематической ошибки вспоминания, а также может частично объяснить различия между исследованиями.

Функциональная независимость (низкий балл по шкале mRS) при выписке из больницы показала, что является значимым фактором для RTW как в текущем, так и в предыдущих исследованиях [36–38]. Кроме того, текущие результаты показывают, что зависимость при выписке (оценка mRS) является более сильным фактором риска отсутствия RTW у пожилых пациентов с OR 6.690, в то время как в младшей группе это не было значимым фактором. В текущем исследовании было решено не включать NIHSS по прибытии в больницу в регрессионный анализ, так как он может значительно меняться от начала инсульта до окончания лечения [39]. Обзор показывает, что разные дефициты трудно совместить с разными типами требований к работе [32]. Например, когнитивные нарушения могут быть препятствием в некоторых видах работы, в то время как двигательные нарушения трудно преодолеть в других. Показатели когнитивного и моторного дефицита в NIHSS были значительно ниже в группе RTW по сравнению с группой без RTW.Несколько предыдущих исследований включали отпуск по болезни до инсульта в качестве потенциального предиктора, однако в текущем исследовании стало ясно, что это был значительный фактор риска для отсутствия RTW. Доказано, что при черепно-мозговых травмах отпуск по болезни до события имеет высокий риск отсутствия RTW после него [40]. Может быть важно учитывать неоднородность в группе, ранее имевшей отпуск по болезни. Различия в продолжительности отпуска по болезни и причинах отпуска по болезни в группе, естественно, приводят к различной вероятности перенесенного инсульта RTW.Знание о том, что функциональный уровень зависимости при выписке из больницы и отпуск по болезни до инсульта влияет на RTW, помогает индивидуализировать усилия по профессиональной реабилитации.

Значительная часть участников этого исследования до инсульта находилась в отпуске по болезни (12,3%) или досрочно вышла на пенсию (17,5%). Для сравнения, в 2010 году 9,0% всего населения Швеции находились в отпуске по болезни (≥ 14 дней), а 4,4% вышли на пенсию досрочно (полный или неполный рабочий день). Это может указывать на то, что люди, перенесшие инсульт, имеют более слабое здоровье, чем население в целом.У пожилых женщин был более высокий риск преждевременного выхода на пенсию до инсульта. Предыдущие исследования показали, что безработица [7] и накопленный отпуск по болезни были факторами риска более позднего инсульта [8]. Однако досрочный выход на пенсию не был связан с более высокой частотой инсультов [8], в отличие от того, что указано в текущем исследовании.

Показатель качества жизни, связанного со здоровьем, по ВАШ в группе RTW был значительно выше, чем в группе без RTW. Никакой существенной разницы в значении индекса, рассчитанном с помощью EQ-5D, не наблюдалось.Причина этого несоответствия неясна, но относительно низкая частота ответов может иметь значение. Связь между высокими баллами и RTW может означать, что люди, которые RTW испытывают более высокое качество жизни, связанное со здоровьем, но также и меньшее количество проблем в областях, которые измеряет EQ-5D, может способствовать RTW. Предыдущие исследования подтверждают более высокое качество жизни, связанное со здоровьем, в группе RTW [9, 41], что подчеркивает важность оптимизации системы поддержки людей RTW.

Ограничения

Есть некоторые проблемы с определением RTW, которые необходимо обсудить.В текущем исследовании не удалось оценить, вернулись ли участники к той же работе с таким же количеством рабочих часов и т. Д. RTW был засчитан как более не зарегистрированный для получения компенсации по болезни или пособия по болезни и не покидающих его из-за выхода на пенсию по старости или смерть. Однако причина отсутствия регистрации в Больничной кассе может быть связана не только с RTW. Лица, занимающиеся всеми видами занятий, имеют право на получение пособия по болезни от этого органа. Например, лицо, которое больше не получает пособие по болезни или компенсацию по болезни, но не получает RTW, может получить социальную помощь от социальных служб Швеции.В данном исследовании это не исследовалось. Кроме того, может случиться так, что самозанятые лица не регистрируются в Управлении медицинского страхования в той же степени, что и работники, поскольку именно работодатель выплачивает пособие по болезни в первые две недели отсутствия. Хотя это, вероятно, относится в основном к краткосрочному отсутствию по болезни. Использование национальных учетных записей позволило включить и проанализировать лиц, приближенных к пенсионному возрасту, поскольку регистрировалось точное количество дней отпуска по болезни, а выход на пенсию учитывался как причина для цензуры.Однако включение лиц старше 60 лет может привести к усилению цензуры, что может повлиять на оценки. Основной результат не учитывал стабильность работы после RTW. Последовательность инсульта может быть трудно совмещать с работой даже в долгосрочной перспективе после RTW. В датском двухлетнем исследовании с последующим наблюдением около 30% действительно перешли с работы на отпуск по болезни в течение одного года после первого перенесенного инсульта RTW [16]. Предлагается провести дальнейшие исследования по изучению стабильности работы после инсульта в долгосрочной перспективе.

Население в текущем исследовании проживало в Гетеборге (городском районе) или поблизости от него, что может повлиять на результаты. Низкий процент ответов (47%) в последующем EQ-5D снижает надежность результатов этого вопросника. Было использовано относительно небольшое количество возможных предикторов для RTW, что привело к риску пренебрежения важными предикторами и искажающими факторами. Например, в предыдущих исследованиях [41–43] было показано, что тип занятий, уровень образования и сопутствующие заболевания являются значимыми факторами, но здесь они не рассматривались.Кроме того, относительно большой CI может указывать на относительно небольшое количество участников в каждой подгруппе, что приводит к неопределенности в отношении точного отношения OR / HR.

Выводы

Не каждый RTW после инсульта. Текущее исследование показало, что RTW возникает в течение более чем трех лет после инсульта. Функциональная зависимость при выписке из больницы, а также наличие отпуска по болезни до инсульта были факторами риска для отсутствия RTW после инсульта.

Благодарности

Особая благодарность исследовательской группе Реабилитационной медицины за помощь и поддержку в этом исследовании.

Вклад авторов

1. Концептуализация: EW HCP KSS.
2. Обработка данных: HCP KSS.
3. Формальный анализ: EW HCP KSS.
4. Приобретение финансирования: KSS.
5. Расследование: EW HCP KSS.
6. Методология: EW HCP KSS.
7. Администрация проекта: EW HCP KSS.
8. Ресурсы: KSS.
9. Кураторство: КСС.
10. Подтверждение: EW HCP KSS.
11. Визуализация: EW HCP KSS.
12. Написание — черновик: EW.
13. Написание — просмотр и редактирование: HCP KSS.

Ссылки

1. 1. Кришнамурти Р.В., Фейгин В.Л., Форузанфар М.Х., Менса Г.А., Коннор М., Беннетт Д.А. и др. Глобальное и региональное бремя первого в истории ишемического и геморрагического инсульта в период 1990–2010 гг .: результаты исследования глобального бремени болезней 2010 г.Ланцет Glob Health. 2013; 1 (5): e259–81. pmid: 25104492
2. 2. Фейгин В.Л., Форузанфар М.Х., Кришнамурти Р., Менсах Г.А., Коннор М., Беннет Д.А. и др. Глобальное и региональное бремя инсульта в 1990–2010 гг .: результаты исследования глобального бремени болезней 2010 г. Lancet. 2014. 383 (9913): 245–54. pmid: 24449944
3. 3. Розенгрен А., Джанг К.В., Лаппас Дж., Джерн С., Торен К., Бьорк Л. Двадцатичетырехлетние тенденции заболеваемости ишемическим инсультом в Швеции с 1987 по 2010 год. Инсульт.2013; 44 (9): 2388–93. pmid: 23839506
4. 4. Стам М., Костенсе П.Дж., Фестен Дж.М., Крамер С.Е. Взаимосвязь между состоянием слуха и участием в различных категориях работы: Демография. Работа. 2013; 46 (2): 207–19. pmid: 24004810
5. 5. Вестлинг М., Туфвессон Б., Иварссон С. Показатели возвращения к работе после инсульта и важность работы для субъективного благополучия и удовлетворенности жизнью. J Rehabil Med. 2003. 35 (3): 127–31. pmid: 12809195
6. 6.Вольфенден Б., Грейс М. Возвращение к работе после инсульта: обзор. Int J Rehabil Res. 2009. 32 (2): 93–7. pmid: 1
   52
7. 7. Марутхаппу М., Шалхуб Дж., Тарик З., Уильямс С., Атун Р., Дэвис А. Х. и др. Безработица, государственные расходы на здравоохранение и цереброваскулярная смертность в мире, 1981–2009 годы: экологическое исследование. Int J Stroke. 2015; 10 (3): 364–71. pmid: 25588453
8. 8. Медин Дж., Нордлунд А., Экберг К. Отпуск по болезни, пенсия по инвалидности и обращение за медицинской помощью до инсульта среди людей в возрасте 30–65 лет: исследование случай-контроль.Brain Inj. 2007. 21 (5): 457–63. pmid: 17522985
9. 9. Родинг Дж., Глэдер Э.Л., Мальм Дж., Линдстром Б. Удовлетворенность жизнью у молодых людей после инсульта: различные предрасполагающие факторы среди мужчин и женщин. J Rehabil Med. 2010. 42 (2): 155–61. pmid: 20140412
10. 10. Клейтон С., Барр Б., Найлен Л., Бёрстром Б., Тилен К., Дидериксен Ф. и др. Эффективность мер по возвращению к работе для людей с ограниченными возможностями: систематический обзор государственных инициатив, направленных на изменение поведения работодателей.Eur J Public Health. 2012; 22 (3): 434–9. pmid: 21816774
11. 11. Ghatnekar O, Persson U, Asplund K, Glader EL. Стоимость инсульта в Швеции в 2009 г. и изменения с 1997 г. Int J Technol Assess Health Care. 2014; 30 (2): 203–9. pmid: 24893970
12. 12. Нильсен МБ, Винслов Хансен Дж., Ауст Б., Тверборгвик Т., Томсен Б.Л., Буэ Бьорнер Дж. И др. Мультицентровое рандомизированное контролируемое исследование своевременности самопомощи получателей пособий по болезни. Датская национальная программа возвращения к работе.Eur J Public Health. 2015; 25 (1): 96–102. pmid: 24577065
13. 13. Hackett ML, Glozier N, Jan S, Lindley R. Возвращение к оплачиваемой работе после инсульта: когортное исследование Psychosocial Outcomes In StrokE (POISE). ПлоС один. 2012; 7 (7): e41795. pmid: 22848610
14. 14. Сингам А., Иттерберг С., Тхам К., фон Кох Л. Участие в сложных и социальных повседневных действиях через шесть лет после инсульта: предикторы возврата к доинсультному уровню. ПлоС один. 2015; 10 (12): e0144344. pmid: 26658735
15. 15.Riks-Stroke (Шведский регистр инсультов). Ett år efter инсульт. 2015. Доступно по адресу: http://www.riksstroke.org/wp-content/uploads/2015/12/Riksstroke_1-%C3%A5rsuppf%C3%B6ljning_LR_13_14.pdf.
16. 16. Ларсен Л.П., Биеринг К., Йонсен С.П., Андерсен Г., Хьоллунд Н.Х. Самостоятельная оценка здоровья и возвращение к работе после первого инсульта. J Rehabil Med. 2016; 48 (4): 339–45. pmid: 26936419
17. 17. Перссон ХК, Парзиали М, Даниэльссон А, Суннерхаген К.С. Исход и функция верхних конечностей в течение 72 часов после первого случая инсульта в неотобранной популяции в инсультном отделении.Часть исследования SALGOT. BMC Neurol. 2012; 12: 162. pmid: 23273107
18. 18. Вихольмен К., Перссон ХК, Суннергаген К.С. Инсульт, пролеченный в нейрохирургическом отделении: когортное исследование. Acta Neurol Scand. 2015; 132 (5): 329–36. pmid: 25819421
19. 19. Молодой FB, Weir CJ, Lees KR. Сравнение шкалы инсульта Национального института здравоохранения с показателями исходов инвалидности в испытаниях острого инсульта. Инсульт. 2005. 36 (10): 2187–92. pmid: 16179579
20. 20. Тисдейл Дж., Маас А., Леки Ф., Мэнли Дж., Стоккетти Н., Мюррей Дж.Шкала комы Глазго в 40 лет: выдерживает испытание временем. Ланцетная неврология. 2014; 13 (8): 844–54. pmid: 25030516
21. 21. van Swieten JC, Koudstaal PJ, Visser MC, Schouten HJ, van Gijn J. Соглашение между наблюдателями по оценке инвалидности у пациентов с инсультом. Инсульт. 1988. 19 (5): 604–7. pmid: 3363593
22. 22. Рабин Р., де Чарро Ф. EQ-5D: показатель состояния здоровья от EuroQol Group. Ann Med. 2001. 33 (5): 337–43. pmid: 114

23. 23. Чионколони Д., Пиу П., Тасси Р., Акампа М., Гайдери Ф., Таддеи С. и др.Взаимосвязь модифицированной шкалы Рэнкина и индекса Бартеля в процессе функционального восстановления после инсульта. Нейрореабилитация. 2012; 30 (4): 315–22. pmid: 22672946
24. 24. де Гроот V, Бекерман H, Lankhorst GJ, Bouter LM. Как измерить коморбидность. критический обзор доступных методов. J Clin Epidemiol. 2003. 56 (3): 221–9. pmid: 12725876
25. 25. Cumming TB, Blomstrand C, Bernhardt J, Linden T. Шкала инсульта NIH может установить когнитивные функции после инсульта.Cerebrovasc Dis. 2010; 30 (1): 7–14. pmid: 20424439
26. 26. Вос П.Е., Баттистин Л., Бирбамер Г., Герстенбранд Ф., Потапов А., Превек Т. и др. Руководство EFNS по легкой черепно-мозговой травме: отчет рабочей группы EFNS. Eur J Neurol. 2002; 9 (3): 207–19. pmid: 11985628
27. 27. Бурстром К., Сан С., Гердтам У. Г., Хенрикссон М., Йоханнессон М., Левин Л. А. и др. Наборы значений для состояний здоровья EQ-5D, основанные на шведском опыте. Qual Life Res. 2014; 23 (2): 431–42. pmid: 23975375
28. 28.Альтман Д.Г. Практическая статистика для медицинских исследований. Лондон: Чепмен и Холл; 1991.
29. 29. Эндо М., Сайренчи Т., Кодзимахара Н., Харуяма Ю., Сато Ю., Като Р. и др. Отсутствие по болезни и возвращение к работе среди японцев, переживших инсульт: 365-дневное когортное исследование. BMJ Open. 2016; 6 (1): e009682. pmid: 26729388
30. 30. Буш М.А., Кошалл С., Хойшманн П.У., МакКевитт С., Вольф CDA. Социально-демографические различия при возвращении на работу после инсульта: Южный Лондонский регистр инсультов (SLSR).Журнал неврологии, нейрохирургии и психиатрии. 2009. 80 (8): 888–93. pmid: 19276102
31. 31. Трегер И., Шамес Дж., Джаквинто С., Ринг Х. Вернуться к работе с пациентами, перенесшими инсульт. Disabil Rehabil. 2007. 29 (17): 1397–403. pmid: 17729085
32. 32. Возняк MA, Kittner SJ. Возвращение к работе после ишемического инсульта: методический обзор. Нейроэпидемиология. 2002. 21 (4): 159–66.
33. 33. Ван Ю.К., Капеллуш Дж., Гарг А. Важные факторы, влияющие на возвращение к работе после инсульта.Работа. 2014; 47 (4): 553–9. pmid: 23531585
34. 34. Анема Дж. Р., Шелларт А. Дж., Кэссиди Дж. Д., Лойзель П., Вирман Т. Дж., Ван дер Бик А. Дж.. Можно ли объяснить различия между странами в возвращении к работе после хронической профессиональной боли в спине? Предварительный анализ политики в отношении инвалидности в когортном исследовании из шести стран. Журнал профессиональной реабилитации. 2009. 19 (4): 419–26. pmid: 19760488
35. 35. Ayis SA, Coker B, Bhalla A, Wellwood I, Rudd AG, Di Carlo A и др. Варианты оказания помощи при остром инсульте и влияние организованной помощи на выживаемость с европейской точки зрения: исследователи Европейского реестра инсультов (EROS).Журнал неврологии, нейрохирургии и психиатрии. 2013. 84 (6): 604–12. pmid: 23385847
36. 36. Петерс Г.О., Буни С.Г., Оейеми А.Ю., Хамзат Т.К. Детерминанты возвращения к работе переживших инсульт в Нигерии. Инвалидность и реабилитация. 2012; 35 (6): 455–9. pmid: 22762207
37. 37. Боннер Б., Пиллай Р., Сарма П.С., Липска К.Дж., Пандиан Дж., Силая П.Н. Факторы, позволяющие прогнозировать возвращение к работе после инсульта у пациентов с легкой и средней степенью инвалидности в Индии. Европейский журнал неврологии.2016; 23 (3): 548–53. pmid: 26518615
38. 38. Танака Х., Тойонага Т., Хашимото Х. Функциональные и профессиональные характеристики, связанные с очень ранним возвращением к работе после инсульта в Японии. Архивы физической медицины и реабилитации. 2011. 92 (5): 743–8. pmid: 21530721
39. 39. Mishra NK, Lyden P, Grotta JC, Lees KR. Тромболизис связан с последовательным функциональным улучшением по всей исходной тяжести инсульта: сравнение результатов у пациентов из Виртуального международного архива исследований инсульта (VISTA).Инсульт. 2010. 41 (11): 2612–7. pmid: 20947852
40. 40. Ларссон Дж., Эсбьорнссон Э., Бьоркдаль А., Морберг И., Нильссон М., Саннерхаген К.С. Больничный после черепно-мозговой травмы. Человек или диагноз — что имеет большее значение? Scand J Public Health. 2010. 38 (5): 541–7. pmid: 20484307
41. 41. Чанг У.Х., Сон М.К., Ли Дж., Ким Д.Й., Ли С.Г., Шин И.И. и др. Возвращение к работе после инсульта: исследование KOSCO. J Rehabil Med. 2016.
42. 42. Ханнерц Х., Хольбек Педерсен Б., Поульсен О.М., Хамле Ф., Андерсен Л.Л.Общенациональное проспективное когортное исследование по возвращению к оплачиваемой работе после инсульта в Дании, 1996–2006 гг. BMJ Open. 2011; 1 (2): e000180. pmid: 22021879
43. 43. Trygged S, Ahacic K, Kåreholt I. Доход и образование как предикторы возврата к трудовой жизни среди молодых пациентов, перенесших инсульт. BMC Public Health. 2011; 11.

Рабочий ход кинезина-14, ncd, состоит из двух подэтапов с разным направлением.

Значение

Моторные белки кинезина, динеина и миозина наиболее известны тем, что они создают линейную силу вдоль осей филаментов цитоскелета.Однако многие из этих двигателей могут также генерировать крутящий момент, проявляющийся в вращении нити накала вокруг своей продольной оси при скольжении по покрытым электродвигателем поверхностям. Комбинируя измеренные продольные и угловые скорости микротрубочек, скользящих на непроцессорных двигателях кинезин-14, с теоретической моделью, мы здесь показываем, что рабочий ход этого двигателя включает по крайней мере два отчетливых конформационных изменения. Наши наблюдения проясняют временную последовательность событий в цикле гидролиза кинезина-14, что не было окончательным из предыдущих структурных данных и данных о единичных молекулах.Более того, наши результаты демонстрируют, как конформационные изменения отдельных ферментов могут быть выведены из их свойств ансамбля.

Abstract

Одномолекулярные эксперименты были использованы с большим успехом для изучения механохимических циклов процессивных моторных белков, таких как кинезин-1, но оказалось трудным применить эти подходы к непроцессивным моторам. Следовательно, механохимический цикл кинезина-14 (ncd) все еще обсуждается. Здесь мы используем показания коллективной активности нескольких двигателей, чтобы получить информацию о механохимическом цикле отдельных двигателей NCD.В тестах скользящей подвижности мы выполнили трехмерную визуализацию на основе флуоресцентной интерференционной контрастной микроскопии в сочетании с нанометровым отслеживанием для одновременного изучения трансляции и вращения микротрубочек. Микротрубочки, скользящие по поверхности, покрытой ncd, вращались вокруг своих продольных осей [ATP] — и [ADP] -зависимым образом. В сочетании с простой механической моделью эти наблюдения предполагают, что рабочий ход ncd состоит из начального небольшого движения его ножки в поперечном направлении, когда высвобождается ADP, и второго, основного компонента рабочего хода, в продольном направлении при ATP. привязка.

Методы исследования одиночных молекул, в частности флуоресценции одиночных молекул (1) и оптического пинцета (2), значительно продвинули наше понимание моторных белков. Такие эксперименты обычно полагаются на процессивность двигателя, что позволяет наблюдать несколько последовательных рабочих циклов (т. Е. Шагов). Хотя механические измерения одиночных молекул на непроцессорных двигателях можно проводить с помощью оптического пинцета (3, 4), они требуют сложного статистического анализа (5, 6) и, если двигатель должен быть исследован под нагрузкой, расширенной обратной связи (7) или сило-зажимные механизмы (8).Направленный к минус-концу С-концевой кинезин-14, ncd, является таким непроцессорным двигателем. Было показано, что он играет важную роль в фокусировке веретена (9-11), а также в скольжении и сшивании микротрубочек (12, 13).

Для рабочего хода одиночного двигателя с ЧПУ была предложена модель плеча рычага (14, 15). Однако, как указано в исх. 16 событие запуска рабочего хода все еще обсуждается. С одной стороны, было предложено, чтобы рабочий ход был связан с расцепителем ADP (14, 17).С другой стороны, предполагается, что он связан со связыванием АТФ с комплексом микротрубочка (МТ) –ncd (4, 15, 18). В другом исследовании было предложено двухэтапное смещение ножки ncd, при котором смещение ножки инициируется связыванием ncd с MT и завершается при связывании ATP (19). Однако, несмотря на то, что для исследования использовались различные подходы, включая рентгеновскую кристаллографию (15), ЭМ (20–23), оптический захват (4, 24), FRET (19) и компьютерное моделирование (25) связь между нуклеотидными состояниями и механическими состояниями ncd, точный механизм еще предстоит выяснить.

В качестве альтернативы непроцессивные двигатели могут быть изучены в тестах скользящей подвижности (26), хотя и с тем недостатком, что одномоторное поведение трудно получить. На поверхности, покрытой ncd, МТ перемещаются своими плюс-концами, ведущими к потреблению АТФ (27, 28). Примечательно, что ncd в тесте скользящей подвижности способен индуцировать вращение MT в дополнение к поступательному движению (28). Заявленное вращение является правым с шагом порядка 300 нм. Это значение не может быть напрямую связано со структурой МТ, как в случае кинезина-1, где вращение МТ в тесте скользящей подвижности является результатом двигателей, следующих за протофиламентами сверхскрученных МТ (29).Пока непонятно, что именно регулирует скорость вращения МП с помощью ncd.

Спиральное вращение филаментов цитоскелета моторными белками уже наблюдалось в ряде случаев: ( и ) вращение МТ процессивными кинезинами (30), непроцессивными кинезинами (31, 32), аксонемными (33) и цитоплазматическими (34) динеины и ( ii ) вращение актиновых филаментов процессивными миозинами (35, 36), а также непроцессивными миозинами (36, 37). Несмотря на их сходство, происхождение этих вращений может быть совершенно различным.В процессивных моторах МТ это может быть следствием побочных действий (30, 38, 39), в процессивных миозинах — из-за несоответствия между шагом актина и размером шага (35), а в непроцессивных миозинах — из-за распределения «целевых зон» для моторики. насадка (40). Когда моторы прикреплены к маленьким шарикам, их относительная ориентация также может играть роль (34), что приводит к изменению спиральности от шарика к шарику. Ни один из этих механизмов не может объяснить вращение МТ непроцессивным кинезином, которое должно быть результатом внутреннего свойства мотора (т.е.е., асимметричный рабочий ход). Существование внеосевой составляющей удара было продемонстрировано экспериментами с оптическими ловушками (24).

Чтобы проанализировать рабочий ход ncd, мы провели эксперименты по коллективному действию двигателей путем одновременного измерения скорости поступательного движения и вращения в тесте скользящей подвижности. Затем мы подогнали собранные данные к простой механической модели. Чтобы ответить на вопрос, с каким переходом состояния нуклеотида связан рабочий ход ncd, мы варьировали кинетику связывания АТФ, регулируя концентрацию свободного АТФ и АДФ.Сравнивая прогноз модели с экспериментальным результатом, мы смогли ( i ) протестировать существующие модели для инициирующего события (событий) рабочего хода ncd и ( ii ) сделать выводы об ориентации и величине возможных подшагов. в рабочем такте однозарядных двигателей.

Результаты

Анализ скользящей подвижности.

Для проведения анализов скользящей подвижности мы позволяем GST-tagged ncd (аминокислоты 195–700) специфически связываться с анти-GST IgG, адсорбированными на отражающей поверхности кремния.Плотность мотора поддерживалась довольно низкой, чтобы предотвратить потенциальные эффекты стерических препятствий, но достаточно высокой, чтобы МТ не отделялись от поверхности во время скольжения. МТ были собраны в присутствии GMP-CPP [гуанилил- (α, β) -метилендифосфонат], таким образом, состоящий почти исключительно из 14 протофиламентов и шага суперповорота 8 мкМ (41, 42). МТ конъюгировали с флуоресцентными квантовыми точками (КТ) и отображали в анализах скользящей подвижности с использованием микроскопии флуоресцентного интерференционного контраста (FLIC). Комбинируя двумерное отслеживание xy позиций и z информации по интенсивностям FLIC, мы проследили трехмерные траектории КТ, тем самым охарактеризовав продольное и угловое движение МТ, как сообщалось ранее (42) (рис.1 А ).

Измерение продольного и углового движения МП, скользящих по поверхности с покрытием ncd. ( A ) Схема экспериментальной установки. ( B ) Прогнозы максимальной интенсивности, полученные из записей временных рядов КТ, прикрепленных к МТ, скользящим по поверхности, покрытой ncd. [АТФ] составлял 1 мМ, 250 мкМ и 85 мкМ (слева направо, как указано). Визуализацию выполняли с использованием микроскопии FLIC с частотой кадров один в секунду (для 1 мМ и 250 мкМ) и один в 2 секунды (для 85 мкМ).Время выдержки составляло 150 мс. ( C ) Типичные кривые интенсивности FLIC и боковых отклонений центров квантовых точек от усредненной траектории — оба графика построены в зависимости от расстояния, пройденного МТ. Кривые соответствуют данным, показанным как максимальные проекции в B . Корреляционные функции этих трасс описаны в Correlation Functions и показаны на рисунке S1.

МТ вращались вправо при движении вперед. Наиболее удивительно наблюдаемый шаг вращения зависел от концентрации АТФ ([АТФ]) и составлял от 1-2 мкм при высоком [АТФ] до нескольких сотен нанометров при низком [АТФ] (рис.1 B и C ; см. также экспериментальные данные на рис. 3). Далее мы измерили продольное и угловое движение в буфере, содержащем АДФ в дополнение к АТФ. Шаги вращения становились длиннее с увеличением концентрации АДФ ([АДФ]), но скорости практически не менялись (см. Экспериментальные данные на рис. S6).

( A ) Общая подгонка модели с трением для всех концентраций АТФ и АДФ. Шаг вращения МТ в зависимости от концентрации АДФ.( B ) Измеренная скорость как функция концентрации АДФ для 75 мкМ АТФ (черный), 200 мкМ АТФ (красный) и 1 мМ АТФ (синий). Сплошная линия показывает прогноз модели.

Модель.

Мы разработали простую механическую модель, которая позволяет связать коллективные свойства двигателей NCD в анализе скользящей подвижности с характеристиками отдельных молекул двигателя. Идея состоит в том, чтобы использовать стандартный подход (43) для продольного движения и расширить его двумя способами. Во-первых, мы разрешаем (но не требуем), чтобы каждое изменение состояния нуклеотида было связано с изменением конформации.Во-вторых, мы допускаем не только продольные конформационные изменения, но и ортогональные угловые. Это означает, что на рабочий ход может происходить несколько конформационных изменений, каждое из которых потенциально состоит из продольной и угловой составляющих. Если конформационные изменения имеют разные направления (разные соотношения между продольным и угловым компонентами), концентрация АТФ может влиять на их относительный вес в ансамбле и, следовательно, на шаг вращения МТ.

Мы начали с моделирования механохимического цикла одиночного двигателя NCD (рис.2 A ), как было предложено в предыдущих исследованиях (44⇓ – 46). Следующие предположения представляют собой общепринятые выводы о механохимическом цикле ncd:

• i ) Связанное с МТ состояние моторных головок со связанным АДФ слабо связано, как свидетельствуют биохимические исследования (46–49 ) и крио-ЭМ (18, 22). Фактически, также сообщалось, что в присутствии ADP ncd моторные головки могут диффундировать вдоль MT с коэффициентом диффузии, соответствующим нескольким сотням шагов по 8 нм в секунду (50).

• ii ) После высвобождения АДФ ncd переходит в сильно связанное (жесткое) состояние, тем самым механически связываясь с MT [видно из констант диссоциации (51) и EM (15, 18, 22)].

• iii ) При связанном с АТФ ncd остается прочно прикрепленным к МТ (15) и отделяется после гидролиза АТФ со связанными АДФ и P _i (52).

• iv ) Все возможные конформационные изменения происходят быстро и связаны с изменениями нуклеотидных состояний двигателя.

Гипотетическая схема механохимического цикла нкд. ( A ) МТ-связывающие состояния (отсоединенный, слабо прикрепленный / диффундирующий и прочно связанный) ncd во время его химического цикла. Химические состояния обозначены D (ADP), 0 (без нуклеотида), T (ATP) и DP (ADP.Pi). ( B ) Вид сверху: молекула ncd присоединяется к MT в состоянии ADP и отделяется в состоянии ADP.Pi. Во время переходов между сильно связанными состояниями ncd потенциально претерпевает характерное продольное и угловое смещение ножки относительно оси MT (исходное положение ножки устанавливается в состояние ADP).N-концевой конец стебля в разных положениях отмечен красными точками. ( C ) Схематическое изображение ncd в анализе скользящей подвижности сразу после сильного связывания ( слева, ) и некоторое время спустя t позже ( справа, ) с использованием сокращенного кинетического цикла. Плечо рычага ncd (ножка) посредством гибкого крепления прикреплено к поверхности. Рабочий ход ncd вызывает продольные (d1, d2) и угловые смещения стержня (δ1, δ2, измеренные вокруг оси MT), которые деформируют соединительный пружинный элемент и приводят к поступательной силе и осевому крутящему моменту на MT.Одновременно движение МП с постоянной скоростью v уменьшает удлинение пружины на расстояние x = vt. Обратите внимание, что смещения стебля являются эффективными позициями; Различие между жесткой ножкой и гибким хвостом следует рассматривать как феноменологическое.

Для механической модели важны только состояния, в которых двигатель тесно связан с MT — мы пренебрегаем любыми силами, которые слабосвязанные двигатели могут оказывать на MT. Таким образом, нам нужно рассмотреть только ту часть механохимического цикла, которая начинается с прочного связывания при высвобождении АДФ и заканчивается отсоединением мотора после гидролиза АТФ, но до высвобождения АДФ и Pi (зеленая рамка на рис.2 А ). Мы не делаем никаких априорных предположений о кинетических скоростях различных стадий механохимического цикла.

Каждое из перечисленных выше состояний связано с определенной позицией ножки, которая может, но не обязательна, перемещаться при изменении состояния нуклеотида (см. Вид сверху на рис. 2 B ). Таким образом, мы не исключаем какой-либо конкретной возможности механохимического цикла. Первое возможное перемещение стержня происходит при отпускании ADP и включает продольные и угловые компоненты, dI и δI.Соответственно, второй сдвиг положения ножки происходит при связывании АТФ и включает компоненты dII и δII. Наконец, АТФ гидролизуется, потенциально вызывая конформационные изменения dIII и δIII с последующим отрывом ncd от MT. Далее мы будем использовать сокращенную кинетическую схему, состоящую только из двух шагов с конформационными изменениями d1, d2 и их угловыми аналогами δ1, δ2. Причины двоякие. Во-первых, мы в первую очередь стремимся протестировать противоречивые модели, в которых рабочий ход связан с высвобождением АДФ, связыванием АТФ или обоими событиями.Во-вторых, мы получили очень похожие результаты и одинаковое качество подгонки независимо от того, использовали ли мы полную или сокращенную кинетическую схему.

Чтобы получить скорость скольжения и шаг вращения для MT, приводимого в действие коллективным действием нескольких электродвигателей ncd, привязанных к поверхности, мы предполагаем, что стержень каждого ncd соединен с упругим элементом (жесткость пружины K ) с поверхностью стекла. (Рис.2 C ). Мы предполагаем, что нити не перемещаются в стороны, а это означает, что угловое смещение двигателей напрямую переводится во вращение MT.Если количество двигателей, одновременно действующих на МТ, достаточно велико, скорость скольжения v будет постоянной во времени, и мы можем решить проблему, определив установившееся распределение состояний двигателя и деформаций на их упругих элементах (моделирование описано в модели Monte-Carlo Simulation и на рис. S2 показано, что аппроксимация почти точна для ансамблей из 20 или более двигателей). Поскольку силы, действующие на двигатели в анализе подвижности, относительно малы, мы предполагаем, что их влияние на кинетические скорости незначительно.Затем кинетика может быть описана простой системой связанных основных уравнений (см. Рис. S3 для примера такой системы, состоящей из четырех состояний).

Моделирование модели без трения методом Монте-Карло с параметрами из таблицы 1 для нитей, покрывающих в среднем 〈N〉 = 20 (красные кружки) и 〈N〉 = 40 (синие квадраты). Сплошными линиями показан результат аналитической модели.

Гипотетическая система с четырьмя последовательными состояниями с равной скоростью перехода.Кривые показывают вероятность того, что молекула находится в состоянии i в момент времени t , если она была в состоянии 1 в момент времени 0. Маленькие столбики обозначают среднее значение каждого распределения.

Суммарная сила, создаваемая всеми двигателями, может быть выражена как среднее количество подключенных двигателей 〈N〉, умноженное на упругую постоянную K и среднюю деформацию двигателя 〈ξ − x〉: F = 〈N〉 K (〈ξ〉 — 〈x〉). [1] Здесь мы ввели ξ как смещение стебля с момента первоначального связывания (рис.S4 A ). В нашей сокращенной двухшаговой модели возможны значения ξ = d1 в состоянии 1 и ξ = d1 + d2 в состоянии 2. x определяется как смещение MT из-за скользящего движения, измеренное от начального связывания (рис. 2 C и рис. S4 A ). Скобки 〈〉 обозначают усреднение по ансамблю среди всех связанных двигателей.

Теоретическая модель. ( A ) Временная последовательность подшагов, показанная в системе отсчета, которая сопутствует MT. ξ обозначает смещение ножки с момента первоначального связывания и меняет свое значение с каждым подшагом.x = vt — смещение скользящего МП относительно поверхности стекла за тот же период. ( B ) Функция выживаемости S (t) (вероятность того, что мотор все еще сильно связан в момент времени t после начального связывания) для двух различных концентраций АТФ. ( C ) Распределения x (черный) и ξ (красный, дискретное распределение). Примеры обоих расстояний как функции времени в течение цикла показаны на вставках. Все параметры имеют подобранные значения для модели без трения.

Среднее смещение стержня 〈ξ〉 всех связанных двигателей получается путем усреднения перемещений стержня (d1 и d1 + d2), взвешенного по доле времени, в течение которого присоединенный двигатель находится в состоянии i (τi / ∑jτj), 〈ξ 〉 = D1τ1τ1 + τ2 + (d1 + d2) τ2τ1 + τ2. [2] τ1 и τ2, среднее время пребывания в состоянии 1 (без нуклеотида) и состоянии 2 (АТФ), связаны с кинетическими скоростями как τ1 = 1k + ATP [ATP] τ2 = 1kdet. [3] Два примера распределений P (ξ) для различных концентраций ATP показаны на рисунке S4 C .

В уравнении. 1 , 〈x〉 — среднее смещение MT между начальным связыванием и точкой наблюдения. Для скользящего движения с постоянной скоростью v он равен 〈vt〉, где t — время с момента начального присоединения. Его можно оценить как 〈t〉 = ∫0∞S (t) t dt∫0∞S (t) dt, [4] где S (t) — вероятность того, что двигатель все еще подключен в момент времени t после начальное сильное связывание («функция выживания» связанного состояния, рис. S4 B ). В модели с двумя связанными состояниями вклад состояния 1 в интеграл в числителе равен τ12, а вклад второго состояния τ2 (τ1 + τ2).Знаменатель — это просто среднее время пребывания в прикрепленном состоянии. Таким образом, мы получаем 〈x〉 = vτ12 + (τ1 + τ2) τ2τ1 + τ2. [5] Два примера вероятностных распределений P (x) показаны на рис. S4 C . Общее обсуждение выражения для 〈x〉 в системе с большим количеством состояний дано в Распределение состояний после сильного связывания .

В тесте скользящей подвижности состояние равновесия силы F = 0 и, следовательно, (уравнение 1 ) 〈ξ〉 = 〈x〉. Вставка уравнений. 2 и 5 в это условие получаем выражение для скорости скольжения v = d1τ1 + (d1 + d2) τ2τ12 + (τ1 + τ2) τ2.[6] Аналогичный расчет угловой скорости дает ω = δ1τ1 + (δ1 + δ2) τ2τ12 + (τ1 + τ2) τ2. [7] Наконец, шаг вращения определяется как λ = 2πvω. [8] Альтернативный вывод уравнения. 6 , в соответствии с подходом основных уравнений, приведено в Альтернативном решении и на рис. S5. Кроме того, результаты подтверждаются моделированием Монте-Карло ( Монте-Карло Моделирование ).

Установившиеся плотности вероятности P1 (x) и P2 (x) как функция линейного расстояния между точкой закрепления двигателя и сайтом связывания микротрубочек.Каждое распределение рассчитано на скольжение без нагрузки. Параметры соответствуют модели без трения из основного текста, а концентрации АТФ составляют 100 мкМ ( Top ) и 1 мМ ( Bottom ). Φ (x) показывает распределение деформаций во время начального сильного связывания.

Для двигателя с одним шагом ограничения скорости (например, d1 = 0, τ1 = 0) скорость (уравнение 6 ) упрощается до хорошо известного выражения v = d / τ, которое часто используется для интерпретировать скорости миозина (53).Если есть два шага ограничения скорости, результат сильно зависит от порядка событий. Если рабочий ход происходит до состояния ожидания АТФ (d1> 0, d2 = 0), результирующая скорость как функция [АТФ] уже имеет другую зависимость, чем скорость АТФазы, которая следует кинетике Михаэлиса-Ментен. Лейблер и Хьюз (43) обнаружили, что для миозина скорость как функция [АТФ] не совсем соответствует закону Михаэлиса-Ментен, но отклонение от закона Михаэлиса-Ментен невелико (они называют это «законом Михаэлиса». ).Однако, если состояние ожидания предшествует рабочему ходу (d1 = 0, d2> 0), зависимость v ([ATP]) становится квадратичной при низких концентрациях ATP. Несмотря на то, что общий рабочий ход такой же, головки проводят большую часть цикла в состоянии предварительного хода и, следовательно, вносят небольшой вклад в поступательное движение. При наличии двух подшагов противоположного направления (d1 <0, d2> 0) теоретически возможно изменение скорости в зависимости от концентрации АТФ (54).

Порядок установки.

Чтобы проверить, правильно ли наша модель описывает свойства МТ, скользящих по поверхности, покрытой ncd, мы извлекли скорости скольжения, частоты вращения и шаги из анализов скользящей подвижности, как описано выше (рис.1) и соответствовала нашей модели (рис. 3, пунктирные линии). Отметим, что параметры этой модели (всего шесть) не могут быть определены только по v и ω . Поэтому мы используем результат, полученный с помощью оптического пинцета (4), который измеряет полное смещение d1 + d2 = 9 нм. Мы не делаем никаких других предположений относительно параметров модели. Затем процедура подбора включает пять параметров для соответствия двум наборам данных (скорость скольжения и шаг вращения).

Зависимость подвижности скользящих МТ от [АТФ] — сравнение экспериментальных данных и модели.( A ) продольная скорость, ( B ) угловая частота и ( C ) шаг вращения. Отдельные точки представляют собой экспериментальные данные (средние значения, полученные из полных вращений ± стандартное отклонение. Все отображаемые данные получены из одного и того же анализа скольжения, когда визуализация проводилась в постоянном поле зрения для поддержания стабильных условий. Концентрация АТФ последовательно снижалась с начального 1 мМ до 40 мкМ. Чтобы исключить артефакты из-за старения образца, контрольные измерения при 1 мМ и 100 мкМ [АТФ] были выполнены после того, как был получен полный набор данных.Подгонки: пунктирные линии в A и C представляют подгонку с использованием базовой версии модели (уравнения 6 — 8 ), а сплошные синие линии — версию модели, включая трение и набор данных ADP (см. Рис. . S6 для полного набора данных). Кривые в B не были подобраны отдельно, но были получены с использованием уравнения. 8 с посадками из A и C .

Хотя в целом модель хорошо соответствует данным, есть небольшие расхождения при низком [ATP] (ниже 100 мкМ), когда модель не соответствует резкому падению скорости.Либо модель предсказывает изменение направления на определенном [ATP], что не наблюдается экспериментально, либо — если мы наложим d1 = 0 — квадратичную зависимость скорости скольжения от [ATP]. Фактически измеренная зависимость скорости скольжения от [АТФ] более пологая при низких концентрациях и круче выше порога. Поэтому мы расширили модель, включив параметр пассивного трения, которое действует на нить накала в дополнение к активным двигателям.

Модель с трением.

Поскольку мы обнаружили, что скорость скольжения не зависит от длины МТ, мы пришли к выводу, что сила трения имеет ту же зависимость от длины, что и тяговое усилие, создаваемое двигателями, число которых линейно зависит от длины МТ.Учитывая возможность того, что часть двигателей имеет ограниченную активность (неактивные или залипшие двигатели), такой подход является разумным.

Таким образом, мы вводим параметр f , обозначающий силу трения на активный двигатель, если нить накала движется. Таким образом, мы моделируем трение совершенно феноменологическим образом и предполагаем, что сила трения постоянна и не зависит от скорости. Когда нить накаливания застопорилась, трение на двигатель может иметь любое значение от 0 до f .Сила трения должна уравновешивать общую силу, создаваемую двигателями, уравнение. 1 , f = τ1 + τ2τoff + τ1 + τ2K (d1τ1 + (d1 + d2) τ2τ1 + τ2 − vτ12 + τ1τ2 + τ22τ1 + τ2). [9] Здесь мы ввели τoff как среднее время, которое двигатель проводит в отсоединенном или слабосвязанное состояние. Затем определяется доля связанных двигателей как среднее время пребывания в прочно связанном состоянии (τ1 + τ2), деленное на общее время цикла (τoff + τ1 + τ2). Скорость v следует как v = d1τ1 + (d1 + d2) τ2 − fK (τoff + τ1 + τ2) τ1 (τ1 + τ2) + τ22. [10] Это выражение верно, пока числитель положителен — в противном случае решение равно v = 0.

Исходя из природы силы трения, мы оцениваем, что она уменьшает продольное и угловое движение на одну и ту же долю. Шаг, определяемый их соотношением, остается таким же, как и в модели без трения (уравнение 8 ), что составляет λ = 2πd1τ1 + (d1 + d2) τ2δ1τ1 + (δ1 + δ2) τ2. [11]

Подгонка модели с трением учитывала данные в присутствии ADP, чтобы избежать переобучения модели. Полученные посадки показаны сплошными линиями на рис. 3. Качество посадки заметно лучше, чем у простой версии модели.

Прямым результатом процедуры подгонки являются значения компонентов рабочего хода, которые представлены подгоночными параметрами (Таблица 1). На рис. 4 показаны значения подшагов рабочего хода для модели с учетом трения. Когда ncd связывается с MT и высвобождается ADP, ножка смещается только вбок, вызывая угловое смещение MT на 6,4 °. При связывании АТФ угловое смещение на 5,3 ° в противоположном направлении сопровождается продольным смещением ножки на 9 нм, что можно рассматривать как основной рабочий ход ncd.

Параметры модели (среднее значение, 95% доверительный интервал)

Продольная и угловая составляющие смещения шеи до и после связывания АТФ; значения основаны на модели, включая трение (не в масштабе).

Модель может быть расширена для расчета скорости и высоты тона в присутствии ADP вместе с ATP. Мы ожидаем, что АДФ в растворе может привести к обращению начального перехода от слабого связывания к сильному и расширить кинетическую схему из рис.2 соответственно. Все модельные расчеты с использованием ADP представлены в модели с учетом наличия ADP . Как правило, высота звука увеличивается с концентрацией АДФ, как мы видим в наших экспериментах. ADP меньше влияет на скорость. Некоторое увеличение может быть вызвано разблокировкой ADP неактивных двигателей и, таким образом, уменьшением трения.

Обсуждение

Мы показали, что рабочий ход ncd состоит из двух подшагов с разными направлениями. Первый подшаг имеет угловое направление (т.е. вне оси) и возникает, когда АДФ расщепляется во время образования комплекса ncd-MT. Второй и по амплитуде основной подэтап происходит, когда АТФ связывается с комплексом ncd-MT.

Наши результаты согласуются с данными крио-ЭМ исследований (15, 18), показывающими крупномасштабное вращение несвязанного моторного домена комплексов ncd-MT в присутствии аденилимидодифосфата (AMP-PNP) (имитирующего АТФ-связанное состояние) по сравнению с конформацией в отсутствие нуклеотида. Эндрес и др. (15) могли даже явно визуализировать поворот шеи на ≈70 ° к минус-концу MT в присутствии AMP-PNP на своих картах плотности EM.Кроме того, в обоих сообщениях (15, 18) обнаружено, что связанный с МТ ncd в отсутствие нуклеотида очень напоминает структуру ncd в состоянии ADP, известную из рентгеновской кристаллографии. Таким образом, структурные исследования, посвященные природе рабочего хода ncd, доказывают, что основной рабочий ход происходит при связывании АТФ. В то же время данные этих исследований показывают, что если есть движение стебля при высвобождении АДФ, оно должно быть очень небольшим. Наши данные, предоставляющие убедительные доказательства двухступенчатого смещения ножки, когда ncd проходит свой механохимический цикл, дополняют эту картину.Без необходимости полагаться на точные числа для направлений и амплитуд смещений, это может быть непосредственно выведено из формул. 8 и 11 (здесь суммировано как уравнение 12 ): λ = 2πvω = 2πd1kdet + (d1 + d2) k + ATP [ATP] δ1kdet + (δ1 + δ2) k + ATP [ATP]. [12] Уравнения действительны для обеих версий нашей модели с трением и без трения (т. Е. Независимо от компонента трения, введенного в расширенной версии модели).

Мы показали, что наша модель адекватно описывает зависимость v , λ и, следовательно, ω от [ATP].В частности, интересно, что λ увеличивается с увеличением [АТФ]. Что означает этот зависящий от [ATP] шаг вращения (уравнение 12 ) для возможных компонентов рабочего хода ncd? Случай d1 = 0 и δ1 = 0 соответствует рабочему ходу, имеющему место исключительно при связывании АТФ. Точно так же случай d2 = 0 и δ2 = 0 будет соответствовать рабочему ходу, имеющему место исключительно при выпуске ADP. В обоих случаях наша модель предсказывает, что шаг λ не зависит от [ATP].Это несовместимо с нашими экспериментальными данными. Напротив, λ становится функцией [ATP], если выполняется условие d1 / δ1 ≠ d2 / δ2. Таким образом, наши экспериментальные данные убедительно свидетельствуют о том, что рабочий ход состоит из двух частей, первая из которых запускается высвобождением АДФ, а вторая — связыванием АТФ. В частности, направления этих подшагов в рабочем такте должны отличаться друг от друга, потому что одинаковые направления будут означать d1 / δ1 = d2 / δ2 = λ / 2π, где λ не будет зависеть от концентрации АТФ.

Помимо этих качественных соображений, количественная подгонка параметров нашей модели помогла определить рабочий ход ncd более детально, чем это было известно ранее. Более ранние эксперименты по измерению механохимического цикла нкд на основе оптического пинцета показали двухэтапный процесс со связыванием нкд с МТ и последующим рабочим ходом (4). Связывание было связано с начальным небольшим смещением вне оси, которое было приписано артефакту из-за экспериментальной геометрии.Внеосевой компонент, который мы обнаружили для первой части рабочего хода, может дать альтернативное объяснение этому наблюдению. Здесь становится очевидной сила нашего метода, работающего с большими ансамблями двигателей в анализе подвижности.

Подобно нашим результатам, недавняя публикация (19) предполагает двухступенчатое смещение ножки — первое при связывании ncd с МТ, а второе при связывании АТФ с двигательным доменом, связанным с МТ. Однако, в отличие от наших соображений, это исследование рассматривает два подшага как части одного большого смещения в одной плоскости без предоставления информации о том, как величины подшагов соотносятся друг с другом.

Подшаг рабочего хода, который происходит при связывании АТФ, также напрямую связан с формой кривой скорости при низком [АТФ]. Поскольку состояние ожидания АТФ происходит перед рабочим ходом, концентрация АТФ влияет на долю времени, в течение которой двигатель пребывает в состоянии до и после рабочего хода. Здесь мы обнаружили, что при низком [АТФ] скорости МТ падали более резко, чем можно было бы ожидать, если бы скорость была прямо пропорциональна скорости АТФазы, которая следует кинетике Михаэлиса-Ментен (рис.3). Интересно, что даже наша базовая модель без растяжения трения хотя бы частично воспроизводит этот эффект. Хотя скорость АТФазы в модели следует закону Михаэлиса-Ментен, предсказанная скорость (уравнение 6 ) и частота вращения (уравнение 7 ) не соответствуют. Подгонка без ограничений также дает отрицательный начальный рабочий ход (d1 <0) и, как следствие, небольшой диапазон концентраций АТФ с обратными скоростями. Отрицательный рабочий ход может соответствовать наблюдениям одиночных молекул, которые показывают долю отрицательных (положительных) смещений (6).Однако мы никогда не наблюдали отрицательных скоростей. Расширенная модель еще лучше соответствует форме кривой скорости, отличной от Михаэлиса – Ментен, что позволяет предположить, что трение может способствовать этому эффекту. В отличие от настоящих экспериментов предыдущий отчет deCastro et al. (55) показывает скорости МТ, соответствующие зависимости Михаэлиса – Ментен. У нас нет объяснения этому несоответствию, хотя другая доля неактивных двигателей может играть роль.

Мы прямо отмечаем, что наши результаты не основаны на ранее измеренных кинетических скоростях ncd.Хотя мы использовали один механический параметр (общий размер рабочего хода) из литературы, мы получили все кинетические параметры путем подгонки и можем сравнить их со значениями из кинетики раствора. Значение k + ATP, которое мы получаем, составляет 0,3 мкМ ^–1 s ^–1 и 0,8 мкМ ^–1 ⋅s ^–1 в модели без трения и с трением соответственно. Для сравнения, прямые кинетические измерения дают значения 1,5 мкМ ^-1 s ^-1 (47), 2 мкМ ^-1 ⋅s ^-1 (46), 0.057 мкМ ^-1 s ^-1 [эффективное значение, рассчитанное из АТФазы в установившемся состоянии (45)] и 1,06 мкМ ^-1 s ^-1 [с mantATP (45)]. Для скорости отрыва после связывания АТФ (kdet) мы получаем 25 с ^-1 (без трения) и 42 с ^-1 (с трением). Сопоставимые кинетические результаты: 14 с ^-1 (45). Скорость отсоединения при связывании ADP — это эффективная скорость, которая заменяет два последовательных шага, и поэтому напрямую не сопоставима.В целом кинетические параметры, полученные с помощью нашей модели, достаточно хорошо согласуются с ранее опубликованными измерениями.

В заключение, мы разработали подход для получения информации об отдельных непроцессивных моторных белках из их коллективного действия. Это может быть полезно в тех случаях, когда действие отдельных молекул невозможно измерить с достаточным разрешением или вообще недоступно. В частности, мы более подробно охарактеризовали рабочий ход ncd. Мы предоставляем доказательства начального небольшого движения ножки ncd в угловом направлении, когда высвобождается АДФ, и второго, основного компонента рабочего хода в продольном направлении, когда АТФ связывается с МТ-связанным моторным доменом.

Материалы и методы

Буферы.

Три типа буферных растворов на основе Hepes были использованы для очистки ncd и для приготовления растворов для различных этапов инкубации при подготовке тестов подвижности скольжения in vitro: ( i ) SB10 (буфер для образцов 10), состоящий из 10 мМ Hepes ( Roth), pH 7,3 доведен с помощью NaOH (Merck), 1 мМ EGTA и 1 мМ MgCl ₂ ; ( ii ) SB50 (буфер для образцов 50), идентичный SB10, за исключением концентрации Hepes, которая составляла 50 мМ; и ( iii ) SB50 + (буфер для образцов 50+), SB50 с добавлением 100 мМ NaCl (Merck / VWR), 1 мкМ таксола (Sigma-Aldrich), 0.2 мг⋅мл ^-1 казеина (Sigma-Aldrich), 10 мМ DTT, 2 мМ Trolox (Fluka), 5 мМ PCA (Sigma-Aldrich) и NaOH (для корректировки pH до 7,3).

Белок кинезин-14.

Все эксперименты были выполнены с использованием GST-ncd ^195-700 , где WT-фрагмент, кодирующий аминокислоты 195-700 ncd, был клонирован в вектор pGEX4T1. Конструкцию очистили в соответствии с ранее описанной процедурой (56). Концентрация соли для элюирования GST-ncd ^195-700 была определена ранее методом FPLC с градиентом соли.

Ncd экспрессировалось в Escherichia coli BL21 pRARE, индуцированных 0,5 мМ изопропил-β-d-тиогалактопиранозидом. Через 16 ч при 15 ° C бактерии собирали центрифугированием при 8000 × g и 4 ° C в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали при концентрации 1 г / мл ^-1 в SB10, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при –80 ° C. Для очистки бактериальный осадок размораживали и разбавляли в буфере A [SB10 с добавлением 50 мМ NaCl, смесь белковых ингибиторов (1 мМ PMSF, 1 мкг · мл ^-1 лейпептин, 1 мкг / мл ^-1 пепстатин A, 2 мкг · мл ^-1 апротинина и 2 мкг · мл ^-1 Nα- p гидрохлорид метилового эфира-тозил-1-аргинина, все от Sigma-Aldrich], 0.5 мМ DTT, 50 мкМ АТФ и 12,5 Ед / мл бензоназы (Novagen). Клетки лизировали с использованием гомогенизатора высокого давления EmulsiFlex-C5 (Avestin). Лизат центрифугировали при 25000 × g в течение 30 мин. Супернатант снова центрифугировали при 140 000 × г в течение 2 часов. Оставшийся супернатант загружали в колонку SP-Sepharose (GE Healthcare), соединенную с перистальтическим насосом. Затем колонку промывали буфером A и затем элюировали буфером B (идентичным буферу A, за исключением 250 мМ NaCl вместо 50 мМ NaCl).Скорость потока составляла около 1 мл⋅мин ^-1 , за исключением элюирования, которое проводилось при примерно 0,5 мл⋅мин ^-1 . Фракции, содержащие элюат, были дополнены 10% (мас. / Об.) Сахарозой. После последующего центрифугирования при 100000 × g и 4 ° C в течение 20 мин супернатант мгновенно замораживали и хранили в жидком азоте.

МЦ.

Используя смесь 98% немеченых, 1% меченых родамином и 1% биотинилированного тубулина крупного рогатого скота (все от Cytoskeleton Inc.) собирали, как описано ранее (42).Сто микролитров 2 мкМ тубулинсодержащего раствора, состоящего из BRB80 [80 мМ Pipes (Sigma), pH 6,9, с КОН (VWR), 1 мМ EGTA (Sigma) и 1 мМ MgCl ₂ (VWR)], 1 мМ GMP-CPP (Jena Bioscience) и 4 мМ MgCl ₂ инкубировали в течение 2 ч при 37 ° C. МТ осаждали при 100000 × г в течение 5 мин с использованием Beckman Airfuge. Осадок ресуспендировали в объеме 50 мкл BRB80 с добавлением 10 мкМ таксола (Sigma).

Тесты скользящей подвижности in vitro.

Анализы скользящей подвижности проводили в проточных камерах, как описано ранее (57).Короче говоря, проточная камера была собрана из функционализированного ПЭГ покровного стекла 22 × 22 мм и Si-чипа 10 × 10 мм с оксидным слоем около 30 нм, покрытым дихлордиметилсиланом (Sigma-Aldrich), с использованием процедуры нанесения покрытия. описано ранее (58). Распорки из пленки NESCO размещали таким образом, чтобы полученные каналы имели размер 10 мм × 1,5 мм × 100 мкм.

Пять микролитров антител против GST (клон: S-tag-05; antibodies-online GmbH) перфузировали в проточную камеру в концентрации 0,02 мг · мл ^-1 (1:50, разведенный в PBS) и позволяли адсорбироваться. на поверхность на 2 мин.Затем поверхность блокировали перфузией 10 мкл Pluronic F127 (Sigma P2443, 1% в PBS и фильтрация 0,2 мкм). Через 15 мин Pluronic F127 был удален с помощью четырех стадий промывки 10 мкл раствора каждой из ( i ) 2 × 10 мкл PBS и ( ii ) 2 × 10 мкл SB10, pH 7,3, и 100 мМ NaCl. Затем 5 мкл 3 мкМ GST-ncd ^195-700 в SB10 с добавлением 100 мМ NaCl, 0,2 мг · мл казеина ^-1 , 100 мкМ АТФ и 10 мМ DTT перфузировали в проточную камеру в диапазоне концентраций от и позволили связываться с антителами в течение 10 мин.Несвязанный мотор удаляли промыванием проточной камеры 4 × 10 мкл SB50, дополненного 100 мМ NaCl, 0,2 мг · мл казеина ^-1 , 100 мкМ АТФ и 10 мМ DTT. МТ в SB50 +, содержащие 1 мМ АТФ, перфузировали в проточную камеру и заменяли через 10 мин раствором, содержащим QD, состоящим из SB50 +, 100 пМ Q655 (Q10121MP; Molecular Probes) и 1 мМ АТФ. После инкубации в течение 10 минут несвязанные КТ удаляли с помощью раствора для визуализации, состоящего из SB50 +, 1 мМ АТФ и 50 нМ PCD (протокатехуат-3,4-диоксигеназа из Pseudomonas sp.; Сигма-Олдрич). Этот буфер для визуализации с переменными концентрациями АТФ в диапазоне от 40 мкМ до 1 мМ (и для экспериментов с АДФ концентрациями АДФ до 1 мМ) перфузировали в проточную камеру для регулирования концентрации АТФ во время эксперимента. Во время визуализации поддерживалась температура 22 ° C. Каждый раз при замене растворов в проточной камере в процессе визуализации освещение образца прерывалось, чтобы предотвратить фототоксическое воздействие на образец.

Оптическое изображение.

Инвертированный флуоресцентный микроскоп (Axiovert 200M; Zeiss), оборудованный иммерсией 63 × 1.Для получения изображения использовались объектив 2 N.A. (Zeiss) и ПЗС-камера с электронным умножением Andor Ixon DV 897 (Andor). Возбуждение флуоресценции достигалось с использованием металлической дуговой лампы Lumen 200 с жидкостным волноводом (Prior Scientific Instruments Ltd.). Для визуализации КТ Q655 и МТ с меткой TAMRA использовались специальные наборы фильтров: Q655: exc 475/42 (Semrock), визуализация dc BS 517, em 655/40 и TAMRA exc HQ 535/50, dc Q 565 LP, em HQ. 610/75 (Технология Chroma). Фильмы временного ряда QD записывались со скоростью от 0.От 1 до 1 кадра в секунду (кадров в секунду) (0,1 кадра в секунду для самых низких концентраций АТФ, 0,25 кадра в секунду при более 60 мкМ, 0,5 кадра в секунду при более 85 мкМ и 1 кадр в секунду при более 150 мкМ). Каждые 50 кадров записывалось изображение TRITC для проверки MT. Время выдержки 150 мс.

Анализ данных.

Положения изображений QD были определены с использованием собственного программного обеспечения для отслеживания одиночных частиц (59) на основе MATLAB (MathWorks). Постобработка этих данных проводилась с использованием MATLAB и Igor Pro v6. Шаг вращения определялся по максимумам и минимумам кривых интенсивности FLIC КТ с МТ, дополненным соответствующими кривыми, показывающими расстояние между положениями КТ от траектории МТ (положительное смещение соответствует смещению влево при взгляде в направление движения).Траектория МТ аппроксимировалась усреднением положений КТ в скользящем окне. Значения были проверены путем взаимной корреляции кривой интенсивности FLIC и кривой отклонения xy ( Correlation Functions ).

Фитинг.

В модели без трения мы применили глобальную аппроксимацию уравнения. 6 для скорости и уравнений. 6 — 8 для данных о шаге винтовой линии. Мы зафиксировали значение d1 + d2 и подобрали оставшиеся пять параметров: k + ATP, kdet, d1, δ1 и δ2.Данные были подогнаны с помощью метода наименьших квадратов, взвешенного с использованием обратного квадрата SE. SE параметров оценивали как квадратный корень из диагональных элементов ковариационно-дисперсионной матрицы (подпрограммы E04FYF и E04YCF группы численных алгоритмов) и 95% доверительных интервалов как среднее ± 1,96 SE. Частота вращения была получена из данных скорости и шага винтовой линии с помощью уравнения. 8 .

При применении модели с трением к данным мы согласовали глобально ( i ) данные скорости с различными концентрациями АТФ в отсутствие АДФ и ( ii ) питчем при разных концентрациях АТФ и АДФ.Опять же, мы использовали процедуру аппроксимации взвешенных наименьших квадратов. Таким образом были определены параметры модели k + ATP, kdet, δ1, δ2, f / K и k + ADP. Мы установили d1 = 0, потому что разрешение ненулевого значения не привело к улучшению качества соответствия. С этими параметрами мы далее рассчитали скорость для различных концентраций ADP и, наконец, частоту вращения по формуле. 8 . Анализ чувствительности результатов подгонки к параметрам d1, d1 + d2, τoff и γ показан в Анализ чувствительности и на рис.S7.

Зависимость относительных значений шести подобранных параметров (левая шкала) от предполагаемых значений d1, d1 + d2, τoff и γ . Зеленые линии (правая шкала) показывают разницу в χ2.

Корреляционные функции

Мы рассчитали корреляционные функции как CII (Δx) = 〈ΔI (x) ΔI (x + Δx)〉 〈(ΔI (x)) 2〉 [S1] Cyy (Δx) = 〈y (x) y (x + Δx)〉 〈(y (x)) 2〉 [S2] и функция взаимной корреляции как CyI (Δx) = 〈y (x) ΔI (x + Δx)〉 〈(y (x)) 2 〉 〈(ΔI (x)) 2〉. [S3] Здесь ΔI (x) обозначает отклонение от средней интенсивности этой траектории как функцию продольного пройденного расстояния.Он служит мерой вертикального смещения z (x). y (x) обозначает боковое отклонение, которое по определению имеет 〈y〉 = 0. Корреляционные функции из наборов данных, которые показаны на рис. 1 для трех концентраций АТФ, оцениваются на рис. S1. Функция взаимной корреляции четко показывает сдвиг фазы на 90 ° между поперечным расстоянием и интенсивностью (вертикальное положение), что указывает на правостороннее спиральное вращение (по часовой стрелке, если смотреть в направлении движения).

Автокорреляционные функции интенсивности FLIC (CII, красный) и бокового смещения (Cyy, синий), а также функция взаимной корреляции между интенсивностью и боковым смещением (CyI, зеленый).

Распределение состояний после сильного связывания

Здесь мы обсуждаем более общую модель, в которой двигатель проходит через N состояний между начальным сильным связыванием и отсоединением. Предполагается, что переходы между состояниями необратимы, а среднее время пребывания в состоянии и равно τi. Вероятность того, что двигатель окажется в состоянии i в момент времени t после начального сильного связывания, проиллюстрирована на рис. S3. Среднее положение плеча рычага среди всех связанных двигателей (обобщение уравнения. 2 ) составляет 〈ξ〉 = ∑i = 1N∑j = iNdiτj∑i = 1Nτi. [S4] Среднее смещение микротрубочек после связывания (которое обобщает уравнение 5 ), затем читается как 〈x〉 = v∑i = 1N∑j = 1iτiτj∑i = 1Nτi. [S5] Можно использовать эти уравнения для получения скорости и угловой скорости как функции [ATP], но обобщение на N состояний не приводит к улучшению качества подгонки по сравнению с модель двух государств.

Альтернативное решение

Далее мы выводим плотности вероятности как функцию деформации для модели с двумя состояниями.Вывод представляет собой альтернативу распределениям, показанным в основном тексте, которые являются функцией времени с момента первоначального связывания. Пусть P0 (t) обозначает вероятность того, что двигатель находится в отсоединенном состоянии, P1 (x, t) — плотность вероятности того, что он находится в состоянии 1, с его корнем на расстоянии x от места связывания MT, а P2 ( x, t) эквивалентная плотность вероятности для состояния 2. Для нити, скользящей со скоростью v , ведущей своим + концом, динамика системы задается следующей системой основных уравнений: (∂∂t + v∂∂ x) P1 (x, t) = 1τoffP0 (t) Φ (x) −1τ1P1 (x, t) [S6] (∂∂t + v∂∂x) P2 (x, t) = 1τ1P1 (x, t) −1τ2P2 (x, t) [S7] ∂∂tP0 (t) = 1τ2∫ − ∞∞P2 (x, t) dx − 1τoffP0 (t) [S8] вместе с условием нормировки P0 (t) + ∫ − ∞∞ (P1 (x, t) + P2 (x, t)) dx = 1.[S9] Φ (x), также нормированный на 1, обозначает распределение деформаций во время прикрепления, которое мы устанавливаем как Φ (x) = K / 2πkBTexp (−Kx2 / 2kBT), но его точная форма не имеет значения. для нашего вывода, пока его среднее значение равно нулю, ∫ − ∞∞Φ (x) xdx = 0.

В стационарном состоянии положим ∂P0 / ∂t = ∂P1 / ∂t = ∂P2 / ∂t = 0 и получим формальное решение P1 (x) = N∫ − ∞∞1vexp (−x − x′τ1v ) θ (x − x ′) Φ (x ′) dx ′ [S10] P2 (x) = N∫ − ∞∞τ2v (τ1 − τ2) (exp (−x − x′τ1v) −exp (−x− x′τ2v)) θ (x − x ′) Φ (x ′) dx ′ [S11] P0 = Nτoff [S12] с N = 1 / (τ1 + τ2 + τoff). Два примера распределений показаны на рис.S5. Напряжение на упругом элементе составляет d1 − x в состоянии 1 и d1 + d2 − x в состоянии 2. Таким образом, среднюю силу на двигатель можно рассчитать как FN = ∫ − ∞∞ (P1 (x) K (d1 − x) + P2 (x) K (d1 + d2 − x)) dx. [S13] Из уравнений. S10 и S11 получаем интегралы − ∞∞P1 (x) dx = Nτ1 ∫ − ∞∞P1 (x) xdx = Nτ12v [S14] ∫ − ∞∞P2 (x) dx = Nτ2 ∫ − ∞ ∞P2 (x) xdx = Nτ2 (τ1 + τ2) v [S15] и, наконец, соотношение силы и скорости FN = N (d1τ1 + (d1 + d2) τ2− (τ12 + τ1τ2 + τ22) v). [S16] Без нагрузки скорость (F = 0) задается формулой v = d1τ1 + (d1 + d2) τ2τ12 + (τ1 + τ2) τ2, [S17] подтверждая уравнение. 6 в основном тексте.

Моделирование Монте-Карло

Мы дополнительно проверили решение модели, сравнив скорость v (уравнение 6 ) и шаг спирали λ (уравнение 12 ) с моделированием Монте-Карло с тем же параметры. При моделировании мы случайным образом распределили двигатели под скользящей микротрубочкой со средней линейной плотностью ρ = 10 мкм − 1. Для простоты разместим все моторы на одной линии (т.е.они имеют одинаковое угловое распределение при присоединении).Для продольной и угловой упругости мы используем значения K = 0,1 пН / нм и γ = 10 кБТ соответственно. Кинетические переходы моделировались алгоритмом Гиллеспи. После каждого шага микротрубочка мгновенно перемещалась для достижения равновесия силы и момента. На рис. S2 показаны результаты для длин нити накала, охватывающих в среднем 〈N〉 = ρL = 20 и 40 двигателей. В обоих случаях отклонение от стационарного аналитического результата незначительно.

Модель с учетом присутствия ADP

Добавление ADP к раствору может привести к отмене начального перехода от слабого связывания к сильному.Обратные переходы должны быть включены в модель таким образом, чтобы она оставалась термодинамически согласованной, придерживаясь принципа детального баланса. Поэтому необходимо более подробное описание углового распределения подключенных двигателей.

Скорость сильного связывания (высвобождение АДФ) с различными участками микротрубочки пропорциональна фактору Больцмана, сформированному из энергии упругого искажения: k − ADP (θ) ∝exp (−γθ22kBT). [S18] Здесь θ обозначает азимутальный угол головки NCD относительно ее ненапряженного положения (т.е.е. угол, на который необходимо повернуть микротрубочку, чтобы снять напряжение). γ представляет собой эффективную угловую упругость двигателя, аналогичную продольной упругости K . После связывания двигатель подвергается внеосевому ходу δ1 (измеренному относительно оси микротрубочки), а общая угловая деформация на нем (теперь в состоянии 0) равна θ + δ1. На этом этапе мы пренебрегаем вращением микротрубочек, когда двигатель связан, потому что это будет иметь лишь небольшой эффект.

Связывание АДФ с последующим переходом от сильного к слабому является обратным вышеописанному переходу.Принцип детального баланса гласит, что k − ADP (θ) k + ADP (θ) ∝exp (−γ (θ + δ1) 22kBT). [S19] Для угловой зависимости скорости связывания ADP следует sk + ADP (θ) = k + ADP0exp (−γ (θ2− (θ + δ1) 2) 2kBT). [S20] Под любым углом θ состояние 0 выходит через связывание АТФ или АДФ. Вероятность того, что двигатель в этом состоянии будет иметь угловую деформацию θ + δ1, пропорциональна P (θ) ∝k − ADP (θ) k + ATP [ATP] + k + ADP (θ) [ADP]. [S21] Отсюда Из уравнения можно определить математическое ожидание угла θ в состоянии 0: θ0 = 〈θ〉 = ∫θP (θ) dθ∫P (θ) dθ.[S22] θ0 является функцией отношения [ADP] / [ATP]. В двух предельных случаях его значение легко понять интуитивно: для [ADP] = 0 мы имеем θ0 = 0, что означает, что средняя угловая деформация двигателей после присоединения равна δ1 — мы уже предполагали это в основном тексте. Для [ATP] = 0 имеем θ0 = −δ1 и двигатели в состоянии 0 в среднем не имеют угловой деформации. Этот предел описывает ситуацию, в которой двигатели находятся в равновесии и не могут создавать крутящий момент.

Чтобы получить исправленные уравнения для λ и v , мы используем следующие соображения.( i ) Заменим внеосевую деформацию в первом связанном состоянии (δ1) на θ0 + δ1. ( ii ) Мы заменяем уравнение. 5 с 〈x〉 = vτ12 + R (τ1 + τ2) τ2τ1 + Rτ2, [S23] где τ1 — скорректированное время пребывания в первом связанном состоянии, τ1 = 1 / (k + ATP [ATP] + k + ADP [ADP]), и R — это вероятность того, что первое состояние выходит через АТФ, а не связывание АДФ, R = k + ATP [ATP] k + ATP [ATP] + k + ADP [ADP]. [S24] Заменитель уравнения. 11 становится λ = 2πd1τ1 + R (d1 + d2) τ2 (θ0 + δ1) τ1 + R (θ0 + δ1 + δ2) τ2 = 2πd1k + ATP0 [ATP] + d1 + d2kdetθ0 ([ADP] / [ATP]) + δ1k + ATP0 [ATP] + θ0 ([ADP] / [ATP]) + δ1 + δ2kdet.[S25] Поскольку θ0 ([ADP] / [ATP]) имеет знак, противоположный δ1, добавление ADP обычно приводит к увеличению высоты звука. Выражение для скорости в модели с трением, которое заменяет уравнение. 10 чтенияsv = d1k + ATP0 [ATP] + d1 + d2kdet-fK (τoff (1 + k + ADP [ADP] k + ATP [ATP]) + 1k + ATP0 [ATP] + 1kdet) 1 / kdet + 1 /(k+ATP0[ATP ])k+ADP[ADP○+k+ATP[ATP ]+(1kdet)2.[S26] Мы использовали эти уравнения, чтобы подогнать данные под ограничение d1 = 0 (конечное d1 приносит нет улучшения качества посадки). Мы глобально подобрали скорость как функцию [ATP], а также высоту звука как функцию [ADP] и [ATP].Кроме того, мы приняли следующие значения: d2 = 9 нм, τoff≈0, γ = 10 kBT (последнее очень слабо влияет на результат). Шаг как функция [ADP] показан на рис. S6 A .

Рис. S6 B показывает скорость как функцию концентрации ADP. Хотя модель предсказывает некоторое увеличение скорости при добавлении АДФ, она не может объяснить сильное увеличение при 75 мкМ АТФ. Возможное объяснение состоит в том, что ADP освобождает некоторые из неактивных двигателей и, следовательно, снижает трение.Уменьшение силы трения на 30% может объяснить увеличение.

Анализ чувствительности

Модель без трения и без ADP содержит единственный свободный параметр, а именно расстояние рабочего хода d1 + d2. Это не влияет на качество подгонки, а другие параметры масштабируются пропорционально δ1, δ1 + δ2, d1 или обратно пропорционально (кинетические скорости).

Модель с трением дополнительно содержит параметры d1 (которые можно подогнать, но они слишком малы, чтобы оправдать подгоночный параметр), τoff и γ .На рис. S7 показана зависимость результатов подгонки, а также качества подгонки (χ2) от этих параметров.

Благодарности

Мы благодарим Корину Бройер и Франциску Фридрих за техническую поддержку, Леннарта Гильберта за комментарии к рукописи и Шэрин Эндов за поддержку на ранней стадии проекта. Эта работа была поддержана стартовым грантом 242933 Европейского исследовательского совета (NanoTrans), грантом программы Гейзенберга Германии DI 1226/4 и грантом Словенского исследовательского агентства P1-0099.

Сноски

• Автор: Б.Н. и С. спланированное исследование; Б.Н. проведенные эксперименты; E.D., L.H. и A.A.K. внесены новые реагенты; B.N., A.V., S.D. проанализированные данные; СРЕДНИЙ. задумал и выполнил моделирование; и Б.Н., А.В., С.Д. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1525313113/-/DCSupplemental.

Продолжительное рабочее время увеличивает риск инсульта, показало крупное исследование | Здоровье и благополучие

Вероятные потери от продолжительного рабочего дня выявлены в новом крупном исследовании, которое показывает, что сотрудники, которые все еще сидят за своими столами в вечернее время, подвергаются повышенному риску инсульта — и чем дольше они работают, тем выше риск .

Крупнейшее исследование, проведенное на трех континентах под руководством ученых из Университетского колледжа Лондона, показало, что у тех, кто работает более 55 часов в неделю, риск инсульта на 33% выше, чем у тех, кто работает 35 лет. — до 40-часовой недели.У них также на 13% повышен риск ишемической болезни сердца.

Полученные данные подтвердят предположения многих о том, что культура сверхурочной работы, в которой люди работают с раннего утра до глубокой ночи, а также работа в выходные дни, потенциально вредна для здоровья.

Исследователи, публикующие свои выводы в медицинском журнале Lancet, говорят, что они не могут категорически утверждать, что долгие часы вызывают у людей инсульты, но их исследование показывает, что связь существует, и она становится сильнее, чем дольше люди работают.

«Внезапная смерть от переутомления часто вызвана инсультом и считается результатом повторяющегося срабатывания стрессовой реакции», — пишут они. «Поведенческие механизмы, такие как отсутствие физической активности, также могут связывать длительный рабочий день и инсульт; гипотеза, подтвержденная доказательствами повышенного риска инсульта у людей, длительное время сидящих на работе.

«Отсутствие физической активности может увеличить риск инсульта за счет различных биологических механизмов, а чрезмерное употребление алкоголя — фактор риска для всех типов инсульта — может быть фактором, способствующим этому, потому что сотрудники, работающие сверхурочно, кажутся немного более склонными к опасному употреблению алкоголя, чем те, кто работает стандартное время.”

По их словам, люди, которые работают сверхурочно, также с большей вероятностью будут игнорировать предупреждающие знаки, что приведет к задержкам в получении лечения.

Мика Кивимяки, профессор эпидемиологии UCL, и его коллеги отдельно рассматривали болезни сердца и инсульт. В отношении ишемической болезни сердца они собрали 25 исследований с участием более 600 000 мужчин и женщин из Европы, США и Австралии, за которыми наблюдали в среднем в течение 8,5 лет.

Затем они объединили и проанализировали собранные данные.Это привело к увеличению на 13% шансов нового диагноза сердечного заболевания, госпитализации или смерти.

Что касается инсульта, они проанализировали данные 17 исследований с участием почти 530 000 мужчин и женщин, за которыми наблюдали в среднем 7,2 года. Они обнаружили, что риск инсульта в 1,3 раза выше у людей, работающих 55 часов и более, по сравнению с теми, кто работает стандартную 35-40 часов в неделю.

Эта связь сохранилась даже после принятия во внимание такого поведения, связанного со здоровьем, как курение, употребление алкоголя и физическая активность, а также стандартных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, включая высокое кровяное давление и высокий уровень холестерина.

Чем длиннее рабочая неделя, тем выше риск инсульта. У тех, кто работает от 41 до 48 часов, риск инсульта выше на 10%, а у тех, кто работает от 49 до 54 часов, риск повышен на 27%.

Кивимяки сказал, что масштаб исследования позволил команде точнее, чем когда-либо прежде, оценивать последствия долгих часов для здоровья. Он посоветовал врачам принять во внимание возможные риски для своих трудолюбивых пациентов. «Медицинские работники должны знать, что сверхурочная работа связана со значительно повышенным риском инсульта и, возможно, также ишемической болезни сердца», — сказал он.

В комментарии к журналу доктор Урбан Джанлерт из Университета Умео в Швеции пишет, что Европейская директива о рабочем времени, ограничивающая продолжительность недели 48 часами, действует не во всех странах. «Продолжительный рабочий день — явление немаловажное. Среди стран-членов ОЭСР в Турции самая высокая доля людей, работающих более 50 часов в неделю (43%), а в Нидерландах — самая низкая (менее 1%).

«Хотя в некоторых странах есть законы, регулирующие рабочее время… это не всегда реализуется. Поэтому важным выводом является то, что продолжительность рабочего дня является важным определяющим фактором в основном для инсультов, но, возможно, и для ишемической болезни сердца ».

Доктор Тим Чико, изучающий сердечно-сосудистую медицину в Университете Шеффилда, сказал, что исследование не доказало, что длительный рабочий день может вызвать инсульт или сердечные заболевания. «Почти наверняка невозможно доказать, существует ли прямая связь, так как это потребует случайного распределения тысяч людей для работы более или менее часов и последующего наблюдения в течение многих лет, чтобы увидеть, изменяет ли это риск инсульта, сохраняя при этом все остальные. одинаковое поведение между группами », — сказал он.

Для многих людей сокращение рабочего времени было бы трудным или невозможным, сказал он. «Большинство из нас могло бы сократить количество времени, которое мы проводим сидя, увеличить нашу физическую активность и улучшить свое питание во время работы, и это может быть тем важнее, чем больше времени мы проводим на работе.